菌根真菌對不同基因型柑橘根際有效磷含量和磷酸酶活性的影響

李艷+吳強盛

摘要：在盆栽條件下對紅橘（Citrus tangerina）、金柑（Fortunella margarita）、枳（Poncirus trifoliata）和資陽香橙（Citrus junos）進行接種或不接種摩西球囊霉（Glomus mosseae），分析菌根化和非菌根化柑橘根際土壤有效磷和磷酸酶活性的變化，結果表明：接種處理顯著提高了柑橘根際土壤有效磷含量以及酸性、中性、堿性和總磷酸酶活性，且這種效應不依賴柑橘基因型；其中，資陽香橙對摩西球囊霉的依賴性最強，其菌根侵染率、根際土壤有效磷含量及其相較于不接種對照處理有效磷含量和土壤磷酸酶活性的增加幅度均最高。相關性分析表明，菌根侵染率與土壤有效磷含量、土壤磷酸酶活性之間均呈現顯著或極顯著正相關關系，有效磷含量與土壤酸性磷酸酶活性間呈顯著正相關關系。

關鍵詞：磷；叢枝菌根；基因型；有效磷；磷酸酶

中圖分類號： S666.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0186-03

收稿日期：2013-09-20

基金資助：湖北省自然科學基金（編號：2012FFA001）。

作者簡介：李艷（1989—），女，湖北宜昌人，碩士研究生，研究方向為果樹菌根生物技術。E-mail：liyan19890201@163.com。

通信作者：吳強盛，博士，教授，研究方向為果樹菌根生物技術。E-mail：wuqiangsh@163.com。磷是植物生長發育的必需營養元素，在植物生長代謝過程中扮演著極其重要的角色，也能提高果樹對外界環境的適應性，如抗旱、抗寒、抗病等[1]。然而，土壤中90%的磷屬于難溶態，植物不能直接吸收，從而導致土壤磷的有效利用率極低。柑橘生長在我國南方的酸性土壤，磷肥的施入容易在土壤中形成難溶的磷酸鐵和磷酸鋁化合物[2]，使得我國多數柑橘生長在低磷條件下，這限制了柑橘的優質和高產。

目前已知在柑橘園土壤中存在一類有益的叢枝菌根真菌，他們能夠與柑橘根系建立共生聯合體——叢枝菌根[3]。叢枝菌根真菌最重要的功能是促進宿主植物對土壤中固有磷素以及外源施入磷肥的吸收和利用，進而改善植物的磷營養，使作物達到優質高產的目的[4]。眾多研究表明叢枝菌根真菌可以分泌磷酸酶，顯著活化土壤中難溶性磷酸鹽，進而提高植物有效磷含量；同時，菌根的根外菌絲可以延伸到植物根系以外的地方汲取土壤中的有效磷[5]。劉進法等研究結果顯示，對枳進行接種摩西球囊霉（Glomus mosseae），其基質中有效磷含量及枳實生苗吸磷效率顯著高于未接種處理[2]。蘇友波等的試驗表明，叢枝菌根真菌對三葉草根際土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均有顯著增強作用[6]；但是也有菌根化的植物種類并不能分泌磷酸酶來改善土壤的有效磷水平或者宿主植物的吸磷量[7]。據此推論，宿主植物的基因型在很大程度上影響叢枝菌根共生體對土壤和植物的磷效應。

本研究以紅橘（Citrus tangerina）、金柑（Fortunella margarita）、枳（Poncirus trifoliata）、資陽香橙（Citrus junos）為試材，研究接種摩西球囊霉對不同基因型柑橘的根際土壤有效磷含量和磷酸酶活性的影響，以及三者之間的相關關系，從而闡明菌根對柑橘磷吸收的相關機理。

1材料與方法

1.1試驗材料

2010年10月收集不同柑橘基因型種子，包括紅橘、金柑、枳、資陽香橙，保存于4 ℃冰箱中。2011年3月26日播種種子。供試的叢枝菌根真菌為摩西球囊霉，經白三葉擴繁，菌劑包含感染根段、沙、根外菌絲和孢子。試驗用盆為塑料盆，規格是：上口內直徑20 cm，盆底內直徑15 cm，盆高 18 cm。盆栽基質為長江大學柑橘園的黃土，預先經高壓蒸汽滅菌（121 ℃，2 h），以消除土中原有的叢枝菌根真菌孢子。

1.2試驗設計

試驗采用2×4雙因素試驗設計。因素1為叢枝菌根真菌接種，包括接種叢枝菌根真菌（+AMF）和不接種叢枝菌根真菌（-AMF）2個處理，接種處理的為菌劑20 g/盆。因素2為柑橘基因型，即紅橘、金柑、枳、資陽香橙。試驗共8個處理，每個處理重復3次，單盆為1個小區，每盆3株實生苗，共24盆，隨機排列。在長江大學園藝園林學院塑料溫室進行。

1.3測定方法

2011年8月16日試驗結束，收獲各個處理的植株及根際土100 g。將當年生根系剪成1～2 cm長的根段，置于FAA固定液中固定保存（至少24 h以上，常溫）。依照Phillips等的方法[8]對根系菌根進行染色，然后在LEICA DME型生物顯微鏡下觀察菌根的侵染。根據吳強盛等提供的公式[9]進行計算：菌根侵染率=（菌根侵染的根段長度/檢查根段的總長度）×100%。

土壤有效磷含量采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定[10]。土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定[11]。

1.4統計分析

運用SAS 8.1軟件的ANOVA過程對處理間作差異性測驗，采用LSD法進行多重比較分析，CORR過程作因子間相關關系分析。

2結果與分析

2.1不同基因型柑橘的菌根侵染率

不同基因型柑橘幼苗接種的菌根侵染率各不相同，其中紅橘為29.82%、金柑為34.41%、枳為54.11%、資陽香橙為54.25%。菌根侵染程度從小到大依次表現為紅橘<金柑<枳<資陽香橙，但紅橘與金柑之間、枳與資陽香橙之間均無顯著差異。

2.2菌根真菌對不同基因型柑橘根際土壤有效磷含量的影響

4種不同基因型柑橘的菌根化植株與非菌根化植株相比，接種顯著提高了根際土壤有效磷的含量，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽香橙分別比非菌根化對照處理提高了37.66%、28.93%、25.58%、41.99%。接種處理之間，以資陽香橙的有效磷含量為最高，并顯著高于其他3種不同基因型柑橘；但紅橘、金柑與枳三者之間差異不顯著。不接種處理根際土壤的有效磷含量也表現出相同規律。2種不同處理（+AMF和-AMF）下，4種不同基因型柑橘的土壤有效磷含量由低到高依次為紅橘<金柑<枳<資陽香橙。endprint

2.3菌根真菌對不同基因型柑橘根際土壤磷酸酶活性的影響

各處理對根際土壤磷酸酶活性（酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶以及總磷酸酶）的影響見圖3，相比于不接種處理，所有的接種處理均顯著提高了根際土壤磷酸酶活性。其中對于酸性磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽香橙分別比非菌根化對照處理提高了82.72%、90.91%、49.25%、17119%（圖3-a）。對于中性磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽香橙分別比非菌根化對照處理提高了11017%、10156%、8621%、120.75%（圖3-b）。對于堿性磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽香橙分別比非菌根化對照處理提高了79.37%、7538%、97.06%、96.55%（圖3-c）。對于總磷酸酶，菌根化紅橘、金柑、枳、資陽香橙分別比非菌根化對照處理提高了89.66%、8986%、78.13%、136.17%（圖3-d）。

接種處理間，各種不同基因型柑橘根際土壤磷酸酶活性也不盡相同。酸性磷酸酶和中性磷酸酶的活性均以金柑為最高，以枳為最低；堿性磷酸酶活性以枳為最高，資陽香橙為最低；但總的來說，4種不同基因型柑橘根際土壤的總磷酸酶活性從低到高依次表現為資陽香橙<枳<紅橘<金柑，非菌根化處理也表現出相同趨勢。

2.4不同基因型柑橘菌根侵染率與根際土壤有效磷、磷酸酶的相關關系

柑橘菌根侵染率與土壤有效磷、酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶及總磷酸酶之間均呈現出極顯著正相關關系。土壤有效磷僅與酸性磷酸酶之間有顯著正相關關系。土壤酸性磷酸酶與中性磷酸酶和總磷酸酶之間存在極顯著正相關關系，與堿性磷酸酶有顯著正相關關系。

不同基因型柑橘菌根侵染率與土壤有效磷、

磷酸酶之間的相關性

指標相關系數X1X2X3X4X5X6X11.0000.560**0.700**0.843**0.572**0.792**X21.0000.405*0.365-0.2340.216X31.0000.884**0.494*0.908**X41.0000.668**0.958**X51.0000.795**X61.000注：X1、X2、X3、X4、X5、X6分別表示菌根侵染率、土壤有效磷、土壤酸性磷酸酶、土壤中性磷酸酶、土壤堿性磷酸酶、土壤總磷酸酶；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3結論與討論

本研究表明，不同基因型柑橘對摩西球囊霉的依賴性不一樣。侵染率最高的資陽香橙對摩西球囊霉的依賴性最強，其余依次為枳、金柑、紅橘。這暗示了叢枝菌根真菌對宿主植物的專一性，宿主植物的種類會在很大程度上影響叢枝菌根的生長發育[12]。

同時，叢枝菌根真菌的生長發育通常在一定程度上由土壤有效磷的高低所決定，表現為土壤有效磷與菌根的發育之間呈顯著或極顯著負相關關系[13]。吳強盛等在桃砧李上也觀察到菌根的侵染明顯受到土壤有效磷的負面影響[14]。但是，本試驗卻發現土壤有效磷與柑橘菌根侵染率之間呈極顯著正相關關系。這可能是因為本試驗是盆栽試驗，土壤本身的有效磷含量極低（不接種處理的有效磷含量僅為0.23～041 mg/kg）。因此，對于4種不同基因型柑橘的接種處理中，菌根侵染率越高的品種其根際土壤有效磷的含量也越高。

相關關系分析表明，菌根侵染率與土壤酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶及總磷酸酶之間均表現出極顯著正相關關系，這進一步證明了接種處理所有基因型柑橘的有效磷含量要顯著高于其相應的對照處理。這與宋勇春等在紅三葉草上試驗結果[15]相一致。本研究顯示，叢枝菌根真菌接種顯著增加了柑橘根際酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶和總磷酸酶活性，且不依賴柑橘基因型，說明菌根對柑橘根際磷酸酶活性的影響不受基因型限制，也進一步證實叢枝菌根在與宿主植物形成共生體后能夠分泌磷酸酶來促進土壤有機磷酸酯的活化與水解，而且植物根系一般只能分泌酸性磷酸酶，因而菌根化植株高活性的堿性磷酸酶則完全是叢枝菌根真菌的功勞[16]。

綜合來看，在其他條件一致的情況下，4種不同基因型柑橘對接種摩西球囊霉在菌根侵染率、土壤有效磷含量及土壤磷酸酶活性的表現效應各不相同。對于菌根侵染率和土壤有效磷含量均以資陽香橙的菌根化效應最強；對于土壤磷酸酶活性，雖然資陽香橙的酸性磷酸酶、中性磷酸酶、堿性磷酸酶及總磷酸酶活性都不是最高，但相比于不接種的對照處理，其提高幅度均為最大。這暗示了本試驗所采用的4個柑橘品種中，資陽香橙對摩西球囊霉的依賴性是最強的。由此可見，在柑橘生產中，充分考慮叢枝菌根真菌與植物磷營養的互作關系是非常必要的。

參考文獻：

[1]Smith S E，Smith F A，Jakobsen I. Mycorrhizal fungi can dominate phosphate supply to plants irrespective of growth responses[J]. Plant Physiology，2003，133（1）：16-20.

[2]劉進法，夏仁學，王明元，等. 叢枝菌根真菌對枳利用難溶性磷酸鹽及其生長的影響[J]. 華中農業大學學報，2008，27（3）：382-386.

[3]Smith S E，Read D J. Mycorrhizal symbiosis[M]. London：Academic Press，1997.

[4]Marschner H，Dell B. Nutrient uptake in mycorrhizal symbiosis[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：89-102.

[5]Hinsinger P. Bio-availability of soil inorganic P in the rhizosphere as affected by root induced chemical changes：a review[J]. Plant and Soil，2001，237（2）：173-195.endprint

[6]蘇友波，林春，張福鎖，等. 不同AM菌根菌分泌的磷酸酶對根際土壤有機磷的影響[J]. 土壤，2003，35（4）：334-338，343.

[7]蘇友波，林春，王三根. AM菌根磷酸酶對玉米菌根際土壤磷的影響及其細胞化學定位[J]. 西南農業大學學報，2003，25（2）：115-119，130.

[8]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Transations of the British Mycological Society，1970，55（1）：158-161.

[9]吳強盛，鄒英寧，占娟. 葡萄叢枝菌根的發育及其與土壤有效磷的關系[J]. 果樹學報，2009，26（3）：311-314.

[10]鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 3版.北京：中國農業出版社，2000.

[11]周禮愷. 土壤酶學[M]. 北京：科學出版社，1987.

[12]Graham J H，Eissenstat D M. Host genotype and the formation and function of VA mycorrhizae[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：179-185.

[13]吳強盛. 園藝植物叢枝菌根研究與應用[M]. 北京：科學出版社，2010.

[14]吳強盛，李國懷，韋啟安. 不同土層桃砧李叢枝菌根發育及其與3個土壤因子的關系[J]. 長江大學學報：自然科學版農學卷，2012，9（6）：25-28.

[15]宋勇春，馮固，李曉林. 泡囊叢枝菌根對紅三葉草根際土壤磷酸酶活性的影響[J]. 應用與環境生物學報，2000，6（2）：171-175.

[16]Tisserant B，Gianinazzi-Pearson V，Gianinazzi S，et al. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections[J].endprint

[6]蘇友波，林春，張福鎖，等. 不同AM菌根菌分泌的磷酸酶對根際土壤有機磷的影響[J]. 土壤，2003，35（4）：334-338，343.

[7]蘇友波，林春，王三根. AM菌根磷酸酶對玉米菌根際土壤磷的影響及其細胞化學定位[J]. 西南農業大學學報，2003，25（2）：115-119，130.

[8]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Transations of the British Mycological Society，1970，55（1）：158-161.

[9]吳強盛，鄒英寧，占娟. 葡萄叢枝菌根的發育及其與土壤有效磷的關系[J]. 果樹學報，2009，26（3）：311-314.

[10]鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 3版.北京：中國農業出版社，2000.

[11]周禮愷. 土壤酶學[M]. 北京：科學出版社，1987.

[12]Graham J H，Eissenstat D M. Host genotype and the formation and function of VA mycorrhizae[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：179-185.

[13]吳強盛. 園藝植物叢枝菌根研究與應用[M]. 北京：科學出版社，2010.

[14]吳強盛，李國懷，韋啟安. 不同土層桃砧李叢枝菌根發育及其與3個土壤因子的關系[J]. 長江大學學報：自然科學版農學卷，2012，9（6）：25-28.

[15]宋勇春，馮固，李曉林. 泡囊叢枝菌根對紅三葉草根際土壤磷酸酶活性的影響[J]. 應用與環境生物學報，2000，6（2）：171-175.

[16]Tisserant B，Gianinazzi-Pearson V，Gianinazzi S，et al. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections[J].endprint

[6]蘇友波，林春，張福鎖，等. 不同AM菌根菌分泌的磷酸酶對根際土壤有機磷的影響[J]. 土壤，2003，35（4）：334-338，343.

[7]蘇友波，林春，王三根. AM菌根磷酸酶對玉米菌根際土壤磷的影響及其細胞化學定位[J]. 西南農業大學學報，2003，25（2）：115-119，130.

[8]Phillips J M，Hayman D S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection[J]. Transations of the British Mycological Society，1970，55（1）：158-161.

[9]吳強盛，鄒英寧，占娟. 葡萄叢枝菌根的發育及其與土壤有效磷的關系[J]. 果樹學報，2009，26（3）：311-314.

[10]鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 3版.北京：中國農業出版社，2000.

[11]周禮愷. 土壤酶學[M]. 北京：科學出版社，1987.

[12]Graham J H，Eissenstat D M. Host genotype and the formation and function of VA mycorrhizae[J]. Plant and Soil，1994，159（1）：179-185.

[13]吳強盛. 園藝植物叢枝菌根研究與應用[M]. 北京：科學出版社，2010.

[14]吳強盛，李國懷，韋啟安. 不同土層桃砧李叢枝菌根發育及其與3個土壤因子的關系[J]. 長江大學學報：自然科學版農學卷，2012，9（6）：25-28.

[15]宋勇春，馮固，李曉林. 泡囊叢枝菌根對紅三葉草根際土壤磷酸酶活性的影響[J]. 應用與環境生物學報，2000，6（2）：171-175.

[16]Tisserant B，Gianinazzi-Pearson V，Gianinazzi S，et al. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections[J].endprint