堿液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖

李會端+秦志玉

摘要：采用堿液冷提法提取程海螺旋藻中的多糖，用顯色法進行定性檢驗，以葡萄糖標準溶液為對照進行測定提取液中多糖的含量并計算提取率。通過單因素試驗初步探究了氫氧化鈉濃度、料液比、浸提時間3個試驗條件對程海螺旋藻中多糖提取率的影響，通過正交試驗最終確定堿液冷提法提取程海螺旋藻中多糖的最佳試驗條件。試驗結(jié)果表明，氫氧化鈉濃度0.4 mol/L、料液比1 ∶25、提取時間2 h為較佳提取條件，測得程海螺旋藻中多糖的提取率為4524%。

關(guān)鍵詞：堿液冷提法；鈍頂螺旋藻；多糖；提取工藝；提取率

中圖分類號： S937.3；R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0255-03

收稿日期：2013-09-23

基金項目：云南省應用基礎(chǔ)研究項目（編號：2012FD050）；楚雄師范學院科學研究基金（編號：11YJGG01）。

作者簡介：李會端（1983—），女，河北寧晉人，博士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物的化學成分分析及應用研究。 E-mail：lhd08@cxtc.edu.cn。多糖是指由10個以上的單糖通過糖苷鍵連成的高分子聚合物，是生命賴以存在的四大基本物質(zhì)之一，按其來源可分為植物多糖、動物多糖、微生物多糖、藻類多糖，其中植物多糖和微生物多糖研究較多，藻類多糖研究相對較少。研究發(fā)現(xiàn)藻類多糖具有顯著的抗病毒、抗腫瘤功能，能抑制癌細胞合成和增殖，提高肌體免疫力，從藻類中提取的多糖類藥物具有顯著的抗艾滋病的功效[1]。對多糖的研究已成為21世紀醫(yī)藥界的熱門領(lǐng)域。螺旋藻屬于藍藻門藍藻綱螺旋藻屬，螺旋藻含有多種生物活性物質(zhì)，具有重要的保健功能和藥用價值，在食品保健、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)有廣泛應用[2]。多糖類化合物是螺旋藻中重要的生物活性物質(zhì)之一，對其進行提取和應用開發(fā)研究具有重要的研究價值。多糖類化合物的提取方法有熱水浸提法、堿液冷提法、酸浸提法、酶解法和超聲提取法[3]。螺旋藻呈弱堿性，不宜采用酸浸提法，而螺旋藻種類和提取方法不同，多糖提取率有很大差異[4-7]。本研究選用麗江程海螺旋藻（屬于鈍頂螺旋藻）為原料，用堿液冷提法提取螺旋藻中的多糖，顯色反應進行定性檢驗，優(yōu)化提取條件，從而確定較佳的提取工藝，以期為程海螺旋藻的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)的試驗數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

麗江程海螺旋藻干粉由麗江永程生物科技開發(fā)有限公司提供，置于恒溫干燥箱中干燥至恒重備用。

葡萄糖（天津市風船化學試劑科技有限公司）、苯酚（廣東光華科技股份有限公司）、硫酸（成都市科龍化工試劑廠）、氫氧化鈉（廣東光華科技股份有限公司）、三氯乙酸（廣東光華化學廠有限公司）、95%乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）、無水乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）、丙酮（成都市科龍化工試劑廠），以上試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

722型光柵分光光度計（山東高密分析儀器廠）、80-2離心機（江蘇大地自動化儀器廠）、SHZ-S2S循環(huán)水式真空泵（鞏義市大地自動化儀器廠）、電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1葡萄糖標準溶液的配制用電子天平準確稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品0.0200 g，在燒杯中用蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中稀釋定容，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標準溶液，備用。

1.3.2苯酚溶液的配制用電子天平準確稱取5.000 0 g苯酚，在燒杯中用蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中稀釋定容，配制成5%的苯酚溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.3.3測定方法依據(jù)以葡萄糖標準液為對照品測定螺旋藻中多糖的含量，加入苯酚和濃硫酸，使多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，在可見光區(qū)獲得穩(wěn)定的特征吸收峰。

1.3.4螺旋藻中多糖提取率計算方法

多糖提取率=稀釋倍數(shù)×測定溶液濃度×容量瓶體積樣品質(zhì)量×100%

將吸光度代入線性回歸方程，計算提取液濃度，再代入上式計算螺旋藻中多糖提取率。

2試驗與結(jié)果分析

2.1最大吸收波長的確定

用吸量管分別移取1.00 mL的葡萄糖標準液、螺旋藻提取液于2支25 mL比色管中，分別加入5%苯酚溶液 1.00 mL，再迅速滴加濃硫酸5.00 mL，混合搖勻，用蒸餾水稀釋定容至10 mL刻度，靜置冷卻至室溫。以試劑空白作對照，在400～550 nm 波長范圍內(nèi)測吸光度，確定最大吸收峰波長。

吸光度測定掃描結(jié)果見圖1。初始階段，葡萄糖標準液和螺旋藻提取液的吸光度都隨著測定波長的增加而增大，當波長增加到490 nm時兩者都達到最大吸收峰值，而后隨著波長增加，吸收峰開始減小，因此選擇490 nm為最大吸收波長，此后的吸光度均在490 nm波長下測定。

2.2葡萄糖標準曲線的繪制

用吸量管分別移取0.2 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于6支25 mL比色管中，各加入5% 苯酚溶液1.00 mL，再迅速滴加濃硫酸 5.00 mL，混合搖勻，用蒸餾水稀釋定容至10 mL刻度，靜置冷卻至室溫，以第1支比色管為空白對照，在最大吸收峰波長處（490 nm）用722型光柵分光光度計測量吸光度。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標準曲線，如圖2所示。根據(jù)葡萄糖標準曲線得線性回歸方程為y=8.862 86x-0.0208 7，相關(guān)系數(shù) r=0.998 6。其中y為吸光度，x為提取液中多糖的濃度。

2.3多糖定性試驗

苯酚-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴5%苯酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。endprint

蒽酮-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。

α-萘酚-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。

將螺旋藻提取液多糖定性試驗結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應試驗結(jié)果均與多糖類化合物顯色反應試驗結(jié)果相同，證明螺旋藻提取液中含多糖類化合物。

螺旋藻提取液多糖定性試驗結(jié)果

試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無

色變成橙紅色溶液顏色呈墨

綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

2.4單因素試驗結(jié)果與分析

2.4.1氫氧化鈉濃度對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min使其混合均勻，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

開始階段，隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加，多糖提取率也不斷增加，當氫氧化鈉溶液濃度超過0.4 mol/L，多糖提取率開始降低。堿液浸提有助于破壞細胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率，但堿液濃度過高則與多糖類化合物發(fā)生脫酯反應和消去反應從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)試驗結(jié)果，最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

2.4.2料液比對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L，調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，堿液浸提2 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以4 000 r/min離心10 min棄去上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。料液比對螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

開始階段，隨著料液比的增加，多糖提取率也不斷增加，當料液比超過1 g ∶25 mL后，多糖提取率開始降低。料液比越大，螺旋藻細胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸發(fā)濃縮過程中損失加劇，從而降低多糖提取率。綜合考慮，選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

2.4.3浸提時間對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL濃度為

0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。浸提時間對螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

浸提時間延長，多糖提取率也逐漸增加，當浸提時間超過1.5 h后，多糖提取率開始降低。原因可能是隨著浸提時間的延長，部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過程中溶解損失，導致多糖提取率降低。綜上試驗，選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時間。

2.5正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時間為變量，多糖提取率為考察指標，考察這3個變量因素對多糖提取率的影響。設(shè)計3因素3水平的正交試驗，因素水平和正交試驗結(jié)果見表2、表3。

3結(jié)果與分析

本研究選用堿液浸提的方法，初步探究了氫氧化鈉溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

濃度、料液比、浸提時間3個因素對程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過單因素試驗和正交試驗對比發(fā)現(xiàn)，3個因素對程海螺旋藻中多糖提取率均有影響，影響程度依次為：B（料液比）>A（提取液濃度）>C（提取時間）。以多糖提取率為考察指標，最優(yōu)試驗條件組合為A2B2C3，氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時間為2 h，程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

曲阜師范大學的研究人員報道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8]；南京中醫(yī)藥大學的研究人員報道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對比發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對較高。

參考文獻：

[1]孫遠征，張學成，紀雷. 鈍頂螺旋藻多糖提取工藝的研究——三氯乙酸（TCA）法的正交試驗優(yōu)化[J]. 海洋科學，2007，31（4）：42-47.

[2]陸杰. 淺談螺旋藻[J]. 醫(yī)藥化工，2008（9）：33-36.

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[4]張文雄，覃海錯，黃文榜，等. 螺旋藻粗多糖提取工藝研究[J]. 廣西化工，1999，28（1）：13-16.

[5]夏冰，郭育濤. 螺旋藻多糖粗提方法的工藝條件研究[J]. 安徽農(nóng)學通報，2010，16（11）：40-41，92.

[6]高憲軍，段濤，王承明. 堿提棉籽粕多糖工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技，2010，31（11）：258-261.

[7]賁永光，鐘紅茂，李康，等. 超聲輔助提取螺旋藻多糖的試驗研究[J]. 中成藥，2011，33（6）：1078-1080.

[8]孫鵬. 極大螺旋藻多糖提取方法研究[J]. 科技情報開發(fā)與經(jīng)濟，2011，21（11）：184-186.

[9]于光，馬宇翔. 鹽澤螺旋藻多糖的最佳獲取條件[J]. 中國農(nóng)學通報，2010，26（23）：108-111.呂興萍，楊薇紅，馬春嬌. 響應面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：258-260.endprint

蒽酮-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。

α-萘酚-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。

將螺旋藻提取液多糖定性試驗結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應試驗結(jié)果均與多糖類化合物顯色反應試驗結(jié)果相同，證明螺旋藻提取液中含多糖類化合物。

螺旋藻提取液多糖定性試驗結(jié)果

試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無

色變成橙紅色溶液顏色呈墨

綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

2.4單因素試驗結(jié)果與分析

2.4.1氫氧化鈉濃度對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min使其混合均勻，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

開始階段，隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加，多糖提取率也不斷增加，當氫氧化鈉溶液濃度超過0.4 mol/L，多糖提取率開始降低。堿液浸提有助于破壞細胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率，但堿液濃度過高則與多糖類化合物發(fā)生脫酯反應和消去反應從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)試驗結(jié)果，最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

2.4.2料液比對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L，調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，堿液浸提2 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以4 000 r/min離心10 min棄去上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。料液比對螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

開始階段，隨著料液比的增加，多糖提取率也不斷增加，當料液比超過1 g ∶25 mL后，多糖提取率開始降低。料液比越大，螺旋藻細胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸發(fā)濃縮過程中損失加劇，從而降低多糖提取率。綜合考慮，選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

2.4.3浸提時間對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL濃度為

0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。浸提時間對螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

浸提時間延長，多糖提取率也逐漸增加，當浸提時間超過1.5 h后，多糖提取率開始降低。原因可能是隨著浸提時間的延長，部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過程中溶解損失，導致多糖提取率降低。綜上試驗，選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時間。

2.5正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時間為變量，多糖提取率為考察指標，考察這3個變量因素對多糖提取率的影響。設(shè)計3因素3水平的正交試驗，因素水平和正交試驗結(jié)果見表2、表3。

3結(jié)果與分析

本研究選用堿液浸提的方法，初步探究了氫氧化鈉溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

濃度、料液比、浸提時間3個因素對程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過單因素試驗和正交試驗對比發(fā)現(xiàn)，3個因素對程海螺旋藻中多糖提取率均有影響，影響程度依次為：B（料液比）>A（提取液濃度）>C（提取時間）。以多糖提取率為考察指標，最優(yōu)試驗條件組合為A2B2C3，氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時間為2 h，程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

曲阜師范大學的研究人員報道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8]；南京中醫(yī)藥大學的研究人員報道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對比發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對較高。

參考文獻：

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[5]夏冰，郭育濤. 螺旋藻多糖粗提方法的工藝條件研究[J]. 安徽農(nóng)學通報，2010，16（11）：40-41，92.

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[9]于光，馬宇翔. 鹽澤螺旋藻多糖的最佳獲取條件[J]. 中國農(nóng)學通報，2010，26（23）：108-111.呂興萍，楊薇紅，馬春嬌. 響應面優(yōu)化酶法提取靈芝多糖工藝條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（6）：258-260.endprint

蒽酮-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴蒽酮溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。

α-萘酚-硫酸反應：取幾滴螺旋藻提取液于試管中，用膠頭滴管滴加3～5滴α-萘酚溶液，混合搖勻后再滴加3～5滴濃硫酸，觀察試驗現(xiàn)象。

將螺旋藻提取液多糖定性試驗結(jié)果列于表1。螺旋藻提取液反應試驗結(jié)果均與多糖類化合物顯色反應試驗結(jié)果相同，證明螺旋藻提取液中含多糖類化合物。

螺旋藻提取液多糖定性試驗結(jié)果

試劑苯酚-硫酸蒽酮-硫酸α-萘酚-硫酸現(xiàn)象溶液顏色由無

色變成橙紅色溶液顏色呈墨

綠色有紫紅色環(huán)產(chǎn)生

2.4單因素試驗結(jié)果與分析

2.4.1氫氧化鈉濃度對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.000 0 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，分別用30 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L）浸提2 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min使其混合均勻，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。氫氧化鈉濃度對多糖提取率影響結(jié)果如圖3所示。

開始階段，隨著提取液氫氧化鈉溶液濃度的增加，多糖提取率也不斷增加，當氫氧化鈉溶液濃度超過0.4 mol/L，多糖提取率開始降低。堿液浸提有助于破壞細胞壁聚合物分子的結(jié)構(gòu)，從而提高多糖提取率，但堿液濃度過高則與多糖類化合物發(fā)生脫酯反應和消去反應從而破壞多糖結(jié)構(gòu)，根據(jù)試驗結(jié)果，最終確定0. 4mol/L為較佳的氫氧化鈉提取液濃度。

2.4.2料液比對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.0000 g干燥至恒重的螺旋藻粉末，固定提取液氫氧化鈉溶液的濃度為0.4 mol/L，調(diào)變料液比分別為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 g/mL，堿液浸提2 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫，加入10 mL的5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入 80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以4 000 r/min離心10 min棄去上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。料液比對螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果如圖4所示。

開始階段，隨著料液比的增加，多糖提取率也不斷增加，當料液比超過1 g ∶25 mL后，多糖提取率開始降低。料液比越大，螺旋藻細胞壁作為半透膜兩側(cè)多糖濃度差越大，有利于多糖浸出，但料液比太大，使得多糖在蒸發(fā)濃縮過程中損失加劇，從而降低多糖提取率。綜合考慮，選取1 g ∶25 mL為多糖提取的較佳料液比。

2.4.3浸提時間對多糖提取率的影響用電子天平準確稱取2.0000g干燥至恒重的螺旋藻粉末，用50mL濃度為

0.4 mol/L 的氫氧化鈉溶液分別浸提0.5、1、1.5、2、2.5 h，過濾，將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液置于沸水浴中蒸發(fā)濃縮至10 mL，待其冷卻至室溫加入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，振蕩5 min，再靜置5 h（除蛋白質(zhì)），將濾液置于離心機中以4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入80 mL 95%乙醇，靜置過夜（進行醇沉），以 4 000 r/min 離心10 min棄去上清液，依次用無水乙醇、丙酮洗劑沉淀數(shù)次，將洗劑后的沉淀在燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移至 100 mL 容量瓶定容，測其吸光度，計算提取液中多糖的提取率。浸提時間對螺旋藻多糖提取率的影響結(jié)果見圖5。

浸提時間延長，多糖提取率也逐漸增加，當浸提時間超過1.5 h后，多糖提取率開始降低。原因可能是隨著浸提時間的延長，部分多糖降解為可溶于乙醇的單糖、寡糖或低聚糖，在醇沉過程中溶解損失，導致多糖提取率降低。綜上試驗，選取1.5 h為螺旋藻中多糖提取的較佳浸提時間。

2.5正交試驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以氫氧化鈉溶液濃度、料液比、浸提時間為變量，多糖提取率為考察指標，考察這3個變量因素對多糖提取率的影響。設(shè)計3因素3水平的正交試驗，因素水平和正交試驗結(jié)果見表2、表3。

3結(jié)果與分析

本研究選用堿液浸提的方法，初步探究了氫氧化鈉溶液

提取率（%）11 113.61021224.20231333.81942124.11252234.52462313.98273134.07283214.32193324.242k111.63111.79411.913k212.61813.04712.556k312.63512.04312.415極差R1.004 1.2530.643主次順序B>A>C優(yōu)水平A2 B2C3優(yōu)組合A2B2C3

濃度、料液比、浸提時間3個因素對程海螺旋藻多糖提取率的影響。通過單因素試驗和正交試驗對比發(fā)現(xiàn)，3個因素對程海螺旋藻中多糖提取率均有影響，影響程度依次為：B（料液比）>A（提取液濃度）>C（提取時間）。以多糖提取率為考察指標，最優(yōu)試驗條件組合為A2B2C3，氫氧化鈉溶液濃度為0.4 mol/L、料液比為1 g ∶25 mL、浸提時間為2 h，程海螺旋藻中多糖提取率為4.524%。

曲阜師范大學的研究人員報道了極大螺旋藻中多糖的提取率為3.935%[8]；南京中醫(yī)藥大學的研究人員報道了鹽澤螺旋藻中多糖的提取率約為27%[9]。對比發(fā)現(xiàn)，鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻的多糖含量低，但相差不大，而鹽澤螺旋藻的多糖含量相對較高。

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