超聲一微波輔助提取枳棋多糖的研究

魏丕偉+熊俐+王凌云+等

摘要：采用超聲-微波聯(lián)合提取技術(shù)從枳椇中提取多糖，通過單因素試驗和正交L9（34）試驗研究了超聲功率、微波功率、提取時間、液料比等條件對枳椇多糖提取的影響。試驗結(jié)果表明：以蒸餾水為提取溶劑，枳椇多糖最佳提取條件為超聲功率500 W、微波功率300 W、提取時間15 min、料液比1 g ∶15 mL，在此條件下枳椇多糖得率為67%；各因素影響強(qiáng)弱依次為超聲功率、微波功率、提取時間、液料比。超聲-微波輔助提取法較傳統(tǒng)的回流提取法具有耗時短、提取率高等優(yōu)點，此法亦具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

關(guān)鍵詞：枳椇；多糖；超聲波；微波；提取工藝

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0263-03

收稿日期：2014-04-20

基金項目：四川理工學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新基金（編號：cx20120407）。

作者簡介：魏丕偉（1983—），男，博士，講師，主要從事生物技術(shù)方面的研究。Tel：（0813）5505979；E-mail：weipiwei2004@163.com。

通信作者：王凌云。E-mail：wanglingyun2004@163.com 。枳椇（Hovenia acerba Lindl.）為鼠李科枳椇屬植物，屬落葉喬木，俗名拐棗、萬壽果、雞腳爪等，我國除東北、新疆、西藏以外大部分省份均有零星分布[1-2]。其藥用部分為帶有肉質(zhì)果柄的果實和種子，該物有清熱利尿解酒毒之功效， 主治酒毒、煩熱、口渴、嘔吐、二便不利等癥[3]。參閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，近年來國內(nèi)外對枳椇屬植物活性成分的研究主要集中在生物堿、黃酮類的提取工藝和藥理方面，對多糖的研究少有見刊[4-5]。本試驗采用超聲微波聯(lián)合提取技術(shù)，利用超聲的空化效應(yīng)以及微波的高能作用[6]，提高枳椇多糖的提取效率，縮短工藝時間，為進(jìn)一步對多糖的研究提供有利條件。

1材料與方法

1.1試驗材料

枳椇購于安國藥材市場，產(chǎn)地湖北。摘取枳椇果柄，用自來水清洗，置于烘箱55 ℃烘干，粉碎，過60目篩，粉末備用。

1.2試劑

蒽酮，分析純，上海科豐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，重慶川東化工有限公司；濃硫酸，分析純，重慶川東化工有限公司；茚三酮，分析純，成都奧克生物有限公司；葡萄糖、石油醚、氯仿、正丁醇等均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.3主要儀器設(shè)備

SL-SM200超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京順流儀器有限公司；Alpha1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST；756型紫外可見分光光度計，上海奧普勒儀器有限公司；TP114電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器設(shè)備公司；RT-34靜音研磨粉碎機(jī)，弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司；等。

1.4試驗方法

1.4.1試驗樣品的前處理對枳椇粉末進(jìn)行脫脂、除單糖處理[7]。

1.4.2多糖含量的測定采用蒽酮-硫酸比色法。蒽酮-硫酸試劑的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照文獻(xiàn)[8]。

1.4.3枳椇多糖的提取與精制稱取經(jīng)過前處理的枳椇果柄粉末，加入相應(yīng)比例蒸餾水，在超聲-微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)置參數(shù)進(jìn)行提取，濾液過濾后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中70 ℃濃縮至1/3；濃縮液加入4倍體積的95%乙醇，沉淀24 h，離心，棄去上清液，沉淀冷凍干燥，得褐色枳椇粗多糖。將粗多糖用蒸餾水溶解，加入1/4體積Sevag混合液（體積比為5 ∶1的氯仿-正丁醇），磁力攪拌1 h，離心，取上層液重復(fù)處理多次直至01%茚三酮乙醇溶液檢測無紫紅色出現(xiàn)。稱取一定量活性炭，80 ℃加熱攪拌15 min，脫色后，離心10 min，棄去沉淀，重復(fù)操作至上清液明顯變清。取溶液，透析袋透析除去離子，最后將溶液冷凍干燥得淺褐色枳椇精制多糖。

1.4.4多糖含量測定及得率計算枳椇多糖的換算因子f=2.174[9]，純度=1/f=1/2.174=46.00%。

多糖含量（mg/g）=多糖稀釋液中葡萄糖濃度（mg/mL）×多糖的稀釋因素試驗樣品質(zhì)量（g）

多糖得率=精制枳椇多糖粉末中多糖的質(zhì)量（g）枳椇果柄中多糖的質(zhì)量（g）×100%

多糖產(chǎn)率=精制枳椇多糖粉末中多糖的質(zhì)量（g）枳椇果柄的質(zhì)量（g）×100%

1.4.5提取條件的選擇以蒸餾水作為提取溶劑，選取超聲功率、提取時間、微波功率、液料比、提取次數(shù)5個因素進(jìn)行單因素試驗，所得提取液過濾后定容至250 mL，再從中移取 5 mL 加入50 mL容量瓶中，使其稀釋10倍，取2 mL稀釋液進(jìn)行硫酸-蒽酮反應(yīng)后測其吸光度，根據(jù)吸光度大小確定每一因素的最佳值。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，從中選擇影響較大的4個因素，每個因素分設(shè)3個梯度水平，采用L9（34）正交表作正交設(shè)計試驗，水提后按上述方法測定其吸光度，計算多糖含量，確定枳椇多糖提取的最佳條件。

1.5試驗方法評價

通過穩(wěn)定性試驗、精密度試驗和重現(xiàn)性試驗的結(jié)果及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，評價本試驗中采用超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)設(shè)備及蒽酮-硫酸比色法是否具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及精密度是否能滿足試驗需求。

2結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（D）為縱坐標(biāo)，測定結(jié)果用最小二乘法作線性回歸，得線性回歸方程為：y=27.064x+0.008 5，r2=0.999（圖1）。

2.2單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1超聲功率對提取效果的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，提取時間為5 min，微波功率為400 W，超聲功率梯度為0、200、400、600、800 W，提取1次。由圖2可知，吸光度隨超聲功率在0～600 W范圍內(nèi)增大而增大，超過600 W后降低。由此分析，適宜強(qiáng)度超聲的空化作用破壞胞壁有利于多糖的溶出從而提高提取效率，而超聲功率過高空化作用增強(qiáng)使其化學(xué)效應(yīng)增加對多糖結(jié)構(gòu)造成破壞，使得吸光度降低。綜合考慮，為避免超聲空化作用對多糖活性的影響，故最佳超聲功率應(yīng)稍低于最高值，選取500 W為宜。endprint

2.2.2提取時間對提取效果的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，微波功率為400 W，提取時間梯度為5、10、15、20、25 min。由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度隨之增大，在15 min時達(dá)到拐點，數(shù)據(jù)曲線變得較為平緩。由分析可見超聲微波聯(lián)合提取法相對于回流提取法在提取時間上有顯著優(yōu)勢。提取時間過長對枳椇粉末有較為顯著的破碎效果而不利于過濾，而且過長的提取時間浪費(fèi)能量，綜合考慮，提取時間選15 min較佳。

2.2.3微波功率對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15min，微波功率梯度為0、200、400、600、800 W。由圖4可知，微波功率達(dá)到400 W時，吸光度達(dá)到最大，其后隨微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知適宜強(qiáng)度微波功率有利于多糖的溶出，而微波過強(qiáng)反而會降低提取效率。

2.2.4料液比對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于相應(yīng)試驗瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15 min，微波功率為400 W。由圖5可知，隨著料液比增大，吸光度增長，但當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶20 mL時，曲線變得較平緩，綜合考慮，選取1 g ∶20 mL為最佳料液比。

2.2.5提取次數(shù)對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于2號試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為 15 min，微波功率為400 W，料液比為1 g ∶20 mL，依次增加提取次數(shù)。由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度也在緩慢上升，其上升幅度較小，重復(fù)提取5次較提取1次吸光度上升幅度小于15%，說明采用超聲微波輔助提取，初次提取率較高，多糖溶出較為充分，再增加提取次數(shù)，多糖浸出率的增加不明顯，為節(jié)約時間和簡化正交試驗步驟，采用1次提取即可。

2.3正交試驗結(jié)果

提取工藝受多個因素影響，且各因素間有交互作用；通過單因素試驗確定各因素的影響程度與作用效果，為進(jìn)一步正交試驗提供依據(jù)。本次正交試驗選取了超聲功率、提取時間、微波功率、料液比4個因素進(jìn)行試驗，每一個因素選取3個水平，通過正交試驗結(jié)果選擇最佳提取條件。（min）D：微波功率

變異來源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05誤差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00。

通過直觀分析，從極差R可判斷4個因素對枳椇多糖提取影響的大小順序為：提取時間>微波功率>料液比>超聲功率（表2）。將極差最小的超聲功率這一項作為誤差列進(jìn)行方差分析，表明提取時間、微波功率這2項具有顯著性差異，說明在提取過程中提取時間和微波功率所設(shè)計的不同水平對提取效率有顯著影響。其他因素水平間差異不顯著（表3）。

從正交試驗結(jié)果可知多糖含量最高的提取組合是A3B1C2D3，由于超聲功率和料液比水平間差異不顯著，且提取時間3水平中 Δk2-1明顯大于Δk3-2，說明隨著時間延長提取時間對提取效果影響減小，故在降低能耗條件下可選取A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間 15 min，微波功率400 W）作為最佳提取條件。在本次試驗中，超聲功率這一因素在正交試驗中極差較小，但在單因素試驗中采用超聲與不用超聲對吸光度有較大影響，說明低功率超聲的空化作用和機(jī)械效應(yīng)有一定的輔助提取作用。

2.4試驗方法評價

2.4.1精密度按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取條件（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同條件下從中取5份樣品液進(jìn)行蒽酮-硫酸比色檢測，測得吸光度分別為0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，計算得相對偏差（RSD）為0.375 8%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析要求。

2.4.2重現(xiàn)性按單因素測定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3條件下得到5份提取液，對5份樣品液進(jìn)行蒽酮-硫酸比色檢測，測得其吸光度分別為0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相對偏差（RSD）為1294%，表明采用超聲-微波組合反應(yīng)設(shè)備進(jìn)行提取的重現(xiàn)性良好，說明該設(shè)備功率穩(wěn)定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.3穩(wěn)定性按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3條件下得到提取液，在常溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min，測定吸光度分別為0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發(fā)現(xiàn)隨時間延長吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0.270%，表明在 180 min 內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

本試驗通過正交試驗得到采用超聲-微波輔助提取設(shè)備提取枳椇多糖的最佳工藝為A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）。在確定最佳工藝條件下枳椇多糖含量為12.715 mg/g，實際提取得到多糖8.505 mg/g，其得率為67%；對比采用回流水提法提取枳椇多糖的文獻(xiàn)，其最佳工藝為：溫度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取時間2 h，提取次數(shù)3次，枳椇多糖含量為 10.288 mg/g，得率62.818%[9]。可見，采用微波輔助提取設(shè)備提取時間短，初次提取率高，多糖產(chǎn)量和得率較回流提取法高，說明采用超聲微波輔助提取法在提取時間和提取效率上有較大優(yōu)越性。

參考文獻(xiàn)：

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[8]張惟杰. 糖復(fù)合生化研究技術(shù)[M]. 2版. 杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：12-13.endprint

2.2.2提取時間對提取效果的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，微波功率為400 W，提取時間梯度為5、10、15、20、25 min。由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度隨之增大，在15 min時達(dá)到拐點，數(shù)據(jù)曲線變得較為平緩。由分析可見超聲微波聯(lián)合提取法相對于回流提取法在提取時間上有顯著優(yōu)勢。提取時間過長對枳椇粉末有較為顯著的破碎效果而不利于過濾，而且過長的提取時間浪費(fèi)能量，綜合考慮，提取時間選15 min較佳。

2.2.3微波功率對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15min，微波功率梯度為0、200、400、600、800 W。由圖4可知，微波功率達(dá)到400 W時，吸光度達(dá)到最大，其后隨微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知適宜強(qiáng)度微波功率有利于多糖的溶出，而微波過強(qiáng)反而會降低提取效率。

2.2.4料液比對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于相應(yīng)試驗瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15 min，微波功率為400 W。由圖5可知，隨著料液比增大，吸光度增長，但當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶20 mL時，曲線變得較平緩，綜合考慮，選取1 g ∶20 mL為最佳料液比。

2.2.5提取次數(shù)對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于2號試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為 15 min，微波功率為400 W，料液比為1 g ∶20 mL，依次增加提取次數(shù)。由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度也在緩慢上升，其上升幅度較小，重復(fù)提取5次較提取1次吸光度上升幅度小于15%，說明采用超聲微波輔助提取，初次提取率較高，多糖溶出較為充分，再增加提取次數(shù)，多糖浸出率的增加不明顯，為節(jié)約時間和簡化正交試驗步驟，采用1次提取即可。

2.3正交試驗結(jié)果

提取工藝受多個因素影響，且各因素間有交互作用；通過單因素試驗確定各因素的影響程度與作用效果，為進(jìn)一步正交試驗提供依據(jù)。本次正交試驗選取了超聲功率、提取時間、微波功率、料液比4個因素進(jìn)行試驗，每一個因素選取3個水平，通過正交試驗結(jié)果選擇最佳提取條件。（min）D：微波功率

變異來源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05誤差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00。

通過直觀分析，從極差R可判斷4個因素對枳椇多糖提取影響的大小順序為：提取時間>微波功率>料液比>超聲功率（表2）。將極差最小的超聲功率這一項作為誤差列進(jìn)行方差分析，表明提取時間、微波功率這2項具有顯著性差異，說明在提取過程中提取時間和微波功率所設(shè)計的不同水平對提取效率有顯著影響。其他因素水平間差異不顯著（表3）。

從正交試驗結(jié)果可知多糖含量最高的提取組合是A3B1C2D3，由于超聲功率和料液比水平間差異不顯著，且提取時間3水平中 Δk2-1明顯大于Δk3-2，說明隨著時間延長提取時間對提取效果影響減小，故在降低能耗條件下可選取A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間 15 min，微波功率400 W）作為最佳提取條件。在本次試驗中，超聲功率這一因素在正交試驗中極差較小，但在單因素試驗中采用超聲與不用超聲對吸光度有較大影響，說明低功率超聲的空化作用和機(jī)械效應(yīng)有一定的輔助提取作用。

2.4試驗方法評價

2.4.1精密度按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取條件（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同條件下從中取5份樣品液進(jìn)行蒽酮-硫酸比色檢測，測得吸光度分別為0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，計算得相對偏差（RSD）為0.375 8%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析要求。

2.4.2重現(xiàn)性按單因素測定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3條件下得到5份提取液，對5份樣品液進(jìn)行蒽酮-硫酸比色檢測，測得其吸光度分別為0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相對偏差（RSD）為1294%，表明采用超聲-微波組合反應(yīng)設(shè)備進(jìn)行提取的重現(xiàn)性良好，說明該設(shè)備功率穩(wěn)定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.3穩(wěn)定性按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3條件下得到提取液，在常溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min，測定吸光度分別為0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發(fā)現(xiàn)隨時間延長吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0.270%，表明在 180 min 內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

本試驗通過正交試驗得到采用超聲-微波輔助提取設(shè)備提取枳椇多糖的最佳工藝為A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）。在確定最佳工藝條件下枳椇多糖含量為12.715 mg/g，實際提取得到多糖8.505 mg/g，其得率為67%；對比采用回流水提法提取枳椇多糖的文獻(xiàn)，其最佳工藝為：溫度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取時間2 h，提取次數(shù)3次，枳椇多糖含量為 10.288 mg/g，得率62.818%[9]。可見，采用微波輔助提取設(shè)備提取時間短，初次提取率高，多糖產(chǎn)量和得率較回流提取法高，說明采用超聲微波輔助提取法在提取時間和提取效率上有較大優(yōu)越性。

參考文獻(xiàn)：

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2.2.2提取時間對提取效果的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，微波功率為400 W，提取時間梯度為5、10、15、20、25 min。由圖3可知，隨著提取時間的延長，吸光度隨之增大，在15 min時達(dá)到拐點，數(shù)據(jù)曲線變得較為平緩。由分析可見超聲微波聯(lián)合提取法相對于回流提取法在提取時間上有顯著優(yōu)勢。提取時間過長對枳椇粉末有較為顯著的破碎效果而不利于過濾，而且過長的提取時間浪費(fèi)能量，綜合考慮，提取時間選15 min較佳。

2.2.3微波功率對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取5份5.000 g枳椇粉末，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于150 mL試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15min，微波功率梯度為0、200、400、600、800 W。由圖4可知，微波功率達(dá)到400 W時，吸光度達(dá)到最大，其后隨微波功率增大，吸光度反而有所下降。由此可知適宜強(qiáng)度微波功率有利于多糖的溶出，而微波過強(qiáng)反而會降低提取效率。

2.2.4料液比對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為5.000 g的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于相應(yīng)試驗瓶中，加入50、100、150、200、250 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為15 min，微波功率為400 W。由圖5可知，隨著料液比增大，吸光度增長，但當(dāng)料液比達(dá)到1 g ∶20 mL時，曲線變得較平緩，綜合考慮，選取1 g ∶20 mL為最佳料液比。

2.2.5提取次數(shù)對提取效率的影響準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為 7.500 g 的枳椇粉末5份，按“1.4.1”節(jié)的方法處理后，分別置于2號試驗瓶中，加入150 mL蒸餾水。在超聲微波聯(lián)合輔助提取儀中設(shè)定試驗參數(shù)，超聲功率為500 W，提取時間為 15 min，微波功率為400 W，料液比為1 g ∶20 mL，依次增加提取次數(shù)。由圖6可知，隨著提取次數(shù)的增加，吸光度也在緩慢上升，其上升幅度較小，重復(fù)提取5次較提取1次吸光度上升幅度小于15%，說明采用超聲微波輔助提取，初次提取率較高，多糖溶出較為充分，再增加提取次數(shù)，多糖浸出率的增加不明顯，為節(jié)約時間和簡化正交試驗步驟，采用1次提取即可。

2.3正交試驗結(jié)果

提取工藝受多個因素影響，且各因素間有交互作用；通過單因素試驗確定各因素的影響程度與作用效果，為進(jìn)一步正交試驗提供依據(jù)。本次正交試驗選取了超聲功率、提取時間、微波功率、料液比4個因素進(jìn)行試驗，每一個因素選取3個水平，通過正交試驗結(jié)果選擇最佳提取條件。（min）D：微波功率

變異來源SSdfMSF值P值B0.013 2 0.006 5.998 >0.05C0.090 2 0.045 42.924 <0.05D0.068 2 0.034 32.485 <0.05誤差0.002 2 0.001 查表得：F0.05（2，2）=19.00，F(xiàn)0.01（2，2）=99.00。

通過直觀分析，從極差R可判斷4個因素對枳椇多糖提取影響的大小順序為：提取時間>微波功率>料液比>超聲功率（表2）。將極差最小的超聲功率這一項作為誤差列進(jìn)行方差分析，表明提取時間、微波功率這2項具有顯著性差異，說明在提取過程中提取時間和微波功率所設(shè)計的不同水平對提取效率有顯著影響。其他因素水平間差異不顯著（表3）。

從正交試驗結(jié)果可知多糖含量最高的提取組合是A3B1C2D3，由于超聲功率和料液比水平間差異不顯著，且提取時間3水平中 Δk2-1明顯大于Δk3-2，說明隨著時間延長提取時間對提取效果影響減小，故在降低能耗條件下可選取A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間 15 min，微波功率400 W）作為最佳提取條件。在本次試驗中，超聲功率這一因素在正交試驗中極差較小，但在單因素試驗中采用超聲與不用超聲對吸光度有較大影響，說明低功率超聲的空化作用和機(jī)械效應(yīng)有一定的輔助提取作用。

2.4試驗方法評價

2.4.1精密度按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末按照最佳提取條件（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）下得到提取液，在相同條件下從中取5份樣品液進(jìn)行蒽酮-硫酸比色檢測，測得吸光度分別為0.770、0.763、0.769、0.756、0.765，計算得相對偏差（RSD）為0.375 8%，表明該方法具有較高的精密度，能滿足樣品分析要求。

2.4.2重現(xiàn)性按單因素測定方法，取5份3.000 g相同原料枳椇粉末，在A1B1C2D3條件下得到5份提取液，對5份樣品液進(jìn)行蒽酮-硫酸比色檢測，測得其吸光度分別為0760、0.768、0.765、0.752、0.744，其相對偏差（RSD）為1294%，表明采用超聲-微波組合反應(yīng)設(shè)備進(jìn)行提取的重現(xiàn)性良好，說明該設(shè)備功率穩(wěn)定，蒽酮-硫酸比色法亦具有良好的重現(xiàn)性。

2.4.3穩(wěn)定性按單因素測定方法，取3.000 g枳椇粉末在A1B1C2D3條件下得到提取液，在常溫下放置0、30、60、90、120、150、180 min，測定吸光度分別為0.734、0.735、0.733、0.733、0.732、0.731、0.729。研究發(fā)現(xiàn)隨時間延長吸光度有下降趨勢，但幅度不大，其相對偏差（RSD）為0.270%，表明在 180 min 內(nèi)樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3結(jié)論與討論

本試驗通過正交試驗得到采用超聲-微波輔助提取設(shè)備提取枳椇多糖的最佳工藝為A1B1C2D3（超聲功率300 W，料液比1 g ∶15 mL，提取時間15 min，微波功率400 W）。在確定最佳工藝條件下枳椇多糖含量為12.715 mg/g，實際提取得到多糖8.505 mg/g，其得率為67%；對比采用回流水提法提取枳椇多糖的文獻(xiàn)，其最佳工藝為：溫度80 ℃，料液比 1 g ∶15 g，提取時間2 h，提取次數(shù)3次，枳椇多糖含量為 10.288 mg/g，得率62.818%[9]。可見，采用微波輔助提取設(shè)備提取時間短，初次提取率高，多糖產(chǎn)量和得率較回流提取法高，說明采用超聲微波輔助提取法在提取時間和提取效率上有較大優(yōu)越性。

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