五味子主要有效成分的綜合提取方法

程振玉+楊英杰+劉治剛+等

摘要：五味子先經水蒸氣蒸餾提取揮發油并收集后，再將水提液與藥渣分離，對水提液濃縮后加入乙醇沉淀多糖，對藥渣采用超聲波-微波輔助乙醇溶液萃取木脂素。結果顯示，與未提揮發油而分別直接水提、醇提的五味子比較，該方法所獲得的五味子多糖、木脂素類成分含量均未有明顯變化。水蒸氣蒸餾法能同時提取五味子揮發油和多糖，剩余藥渣可作為原料，采用超聲波-微波法繼續提取木脂素，消耗時間短，溶劑用量小，操作簡便。由此可知，該方法能節約資源，降低成本，充分提高藥用資源五味子的利用率。

關鍵詞：五味子；揮發油；多糖；木脂素；超聲波-微波法；綜合提取

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0273-03

收稿日期：2013-10-08

作者簡介：程振玉（1986—），男，碩士研究生，研究方向為天然產物化學。E-mail：844503608@qq.com。

通信作者：楊英杰。E-mail：yanghjm@163.com。五味子是五味子科植物五味子（Schisandra chinensis Baill）的干燥成熟果實，主產于吉林、遼寧、黑龍江、內蒙古等地[1]。五味子具有很高的藥用價值，《中華人民共和國藥典》（2010年版）中明確指出五味子具有收斂固澀、益氣生精、補腎寧心之功效，用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、盜汗、短氣脈虛、心悸失眠等癥[2-3]。五味子除藥用外，還可以作為調味劑和食品添加劑用于燉魚燉肉、熬湯、熬粥、泡茶、加工酸奶等果汁飲料[4-6]。現代藥理研究表明，多糖、揮發油、木脂素[7-9]是五味子的主要活性成分。其中，木脂素尤其是聯苯環辛烯類木脂素（其成分包括五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素）[10]，除了具有保肝降酶、止咳、抗炎消毒作用外，還具有抗氧化、抗衰老、抗癌癥、消除疲勞、增強機體免疫力等活性[6，8]，已廣泛用于臨床治療。多糖具有與之類似的活性，且對糖尿病有顯著的治療效果。揮發油具有良好的鎮咳作用，其效力相當于75%的可待因[11]。五味子醇甲、五味子酯甲等木脂素類成分在傳統提取方法中主要采用冷浸法、回流法和滲漉法等，這些方法提取時間長、活性成分提取率低；超聲波-微波協同萃取新技術將超聲波與微波2種作用相結合，充分利用超聲波振動的空化作用和微波的高能作用，克服了常規超聲波和微波萃取的不足之處，具有溶劑用量少、提取時間短、提取效率高、操作簡單等優點；RP-HPLC分析方法準確、靈敏度高、重現性好。本研究對五味子木脂素的萃取方法進行了改良，建立了超聲波-微波協同萃取-高效液相色譜同時檢測5種木脂素的方法。關于五味子木脂素、揮發油、多糖提取方面的相關文獻報道較多，但是對上述活性物質的提取都是分開進行的，某單一成分提取后的藥渣往往被作為廢棄物扔掉，嚴重浪費了五味子的藥用資源，因此研究綜合利用五味子的意義越來越重要，一種綜合提取木脂素、揮發油、多糖的新方法亟需建立。本研究先采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，再將水提液與藥渣分離，對水提液進行醇沉，對藥渣采用超聲波-微波法再次提取。通過將本提取方法與未提油而分別直接水提、醇提五味子的方法進行比較，探討五味子揮發油、多糖與木脂素綜合提取新方法的可行性。

1材料與方法

1.1儀器

P230依利特高效液相色譜儀，EC2000色譜工作站，配UV-230+紫外可見檢測器，722型-可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司），CW-2000A超聲波-微波協同萃取/反應儀（中山大學-上海新拓分析儀器科技有限公司），RT-08多功能粉粹機（榮聰精密科技有限公司），RE-52A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），Allegra 64R離心機（BACKMAN公司），SHZ-D循環水式真空泵（河南省鞏義市英峪儀器一廠）。

1.2藥品及試劑

五味子藥材購買于吉林省通化市，產地為長白山地區，經吉林化工學院環境與生物工程學院隋新副教授鑒定為五味子的干燥果實。

對照品五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素來自中國藥品生物制品檢定所，五味子醇甲、五味子丙素來自上海源葉生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，試驗用水為超純水。

1.3測定項目與方法

1.3.1五味子木脂素含量的測定

1.3.1.1高效液相色譜條件Hypersil ODS C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。流動相為乙腈（A）和水（B）：0～10 min，40%～55%A；10～20 min，55%～68% A；20～25 min，68%～74% A；25～32 min，74%～75% A；32～37 min，75%～100% A；37～48 min，100%A；48～48.1 min，100%～40%A；48.1～65 min，40%A。檢測波長225 nm，柱溫25 ℃，進樣量20 μL。

1.3.1.2木脂素標準曲線的建立取置于干燥器中48 h以上的各對照品，精確適量稱取，分別加甲醇溶解并定容，得到1.023 mg/mL五味子醇甲、1.046 mg/mL五味子酯甲、1.261 mg/mL 五味子甲素、1.104 mg/mL五味子乙素、1.026 mg/mL 五味子丙素單對照品儲備液。

分別精確量取各對照品儲備液適量，依次配成質量濃度為204.6、209.2、252.2、220.8、205.2 μg/mL的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素混合對照品溶液。先用2倍稀釋法連續稀釋3次后，再采用5倍稀釋法連續稀釋2次，得到6個濃度的混合對照品溶液。按照“131”高效液相色譜條件進樣，以各木脂素相應的峰面積y為縱坐標、質量濃度x（μg/mL ）為橫坐標繪制標準曲線，結果見表1。表15種木脂素的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢測限和檢出限endprint

（μg/mL）五味子醇甲y=97.178x+317.020.999 21.0～204.60.041 50.123 6五味子酯甲y=97.787x+73.3830.999 91.0～209.20.047 60.141 5五味子甲素y=107.48x-427.320.999 91.3～252.20.031 80.098 3五味子乙素y=103.35x-102.400.999 81.1～220.80.029 20.087 9五味子丙素y=106.91x-60.7840.999 81.0～205.20.050 70.152 1

1.3.2五味子多糖含量的測定按照苯酚-硫酸法[12]，以葡萄糖為標準樣，在最大吸收波長490 nm處測定吸光度。以吸光度D為縱坐標、葡萄糖濃度C（g/mL）為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為D=0.009 9C-0.017 9，決定系數r2=0999 7。

多糖得率=多糖質量藥材質量×100%

1.3.3揮發油、多糖與木脂素單一成分提取

1.3.3.1水蒸氣蒸餾法提取揮發油五味子粉碎，過120目篩，于 60 ℃下烘干，精確稱取一定的量，參照沈文等優化的方法[13]，按料液比1 g ∶5 mL加入蒸餾水，浸泡1 h，水蒸氣蒸餾5 h，靜置1 h，收集揮發油，加入無水硫酸鈉脫水干燥，備用。

1.3.3.2回流法提取多糖五味子粉碎，過120目篩，于60 ℃下烘干，精確稱取10.0 g，根據郭志欣等報道的五味子多糖的最佳提取工藝[14]，按照料液比1 g ∶30 mL加入蒸餾水，于100 ℃下回流提取4 h，提取液經離心后收集上清液，用旋轉蒸發儀濃縮至1 g ∶2 mL（粉末質量 ∶濃縮液體積），加無水乙醇至體積分數為80%[15]，4 ℃下靜置過夜，離心，沉淀用無水乙醇洗滌數次，真空干燥得粗多糖。取適量，用蒸餾水溶解，記為多糖提取液Ⅰ，含量測定結果見圖1。

1.3.3.3超聲波-微波協同法萃取木脂素五味子粉碎，過120目篩，60 ℃烘干后精確稱取10.0 g，通過設計響應面試驗對超聲波-微波萃取木脂素工藝進行優化，確定按照料液比1 g ∶10 mL加入80%乙醇，在超聲波頻率、功率分別為40 kHz、50 W條件下，以150 W的微波功率萃取10 min，減壓抽濾，燒瓶及藥渣添加少量提取溶劑洗滌數次，繼續抽濾，合并全部濾液；用旋轉蒸發儀濃縮，干燥得木脂素浸膏；精確稱取少量木脂素浸膏，用甲醇溶解，配成一定濃度，記為木脂素提取液Ⅰ，取少量過0.22 μm尼龍微孔濾膜，進樣20 μL，高效液相色譜檢測，木脂素色譜分離圖和含量分別見圖2-A和表2。

2揮發油與木脂素、多糖綜合提取試驗

提取揮發油的藥渣，60 ℃恒溫干燥24 h，重新粉碎直至完全過120目篩，一份加入300 mL蒸餾水，按照“1.3.3.2”節所述方法回流提取結束，加入乙醇沉淀過夜，沉淀用無水乙醇洗滌數次后，取適量配成一定濃度溶液，記為多糖提取液Ⅲ，含量測定結果見圖1；另一份加入100 mL 80%乙醇溶液，按照“1.3.3.3”節所述，超聲波-微波法協同萃取，干燥得木脂素浸膏，然后取適量用甲醇溶解，取少量過0.22 μm尼龍微孔濾膜，記為木脂素提取液Ⅲ，進樣20 μL，高效液相色譜檢測，木脂素色譜分離圖和含量分別見圖2-C和表2。

提油藥渣（多糖提取液Ⅲ）中多糖含量僅為0.09%，而從提油藥渣分離的水溶液中（多糖提取液Ⅱ）的多糖含量與直接從五味子提取的量（多糖提取液Ⅰ）沒有差別，表明水蒸氣蒸餾法提取五味子揮發油時，多糖也完全浸出，并且充分溶解到水中，提取油后的藥渣幾乎不含多糖。因此可以采用先水蒸氣蒸餾提取揮發油，然后分離藥渣，水提液加入乙醇沉淀，精制多糖。

圖2 -D為五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的混合標準樣色譜圖。從圖2 -A、2-B可以看出，直接醇提與提油后的藥渣醇提這2種方法所得木脂素色譜分離圖非常相近，沒有任何峰的缺失，且相同的峰對

應的面積基本相等。從圖2-C可以看出，木脂素提取液Ⅱ中只含有極少量的五味子醇甲，五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素等其他木脂素類成分都不能檢測到。

提油藥渣中只有五味子醇甲含量略有降低，其他木脂素的含量都沒有明顯變化。與原藥材的提取率相比，藥渣中5種木脂素的含量已經超過95%，表明水蒸氣蒸餾法提取揮發油不會造成木脂素類成分的損失，因此可以采取揮發油與木脂素相結合的方法提高五味子資源的利用率。

3結論與討論

揮發油、多糖和木脂素是五味子的主要活性成分，本研究首次對五味子揮發油提取前后多糖與木脂素含量的變化進行了整體分析。結果顯示，揮發油提取后，木脂素類化合物含量沒有明顯變化，多糖類物質的含量急劇降低。但是，經過對藥渣中殘留的水溶液進行檢測后發現，其中所含的多糖類物質與五味子直接水提的含量沒有差別，表明水蒸氣蒸餾法提取揮發油時，多糖類物質已經被完全提取出來且轉移到水中。由此可知，五味子可以通過水蒸氣蒸餾法同時獲得多糖和揮發油，剩余殘渣作為原料繼續提取木脂素，使有效成分得到綜合利用。該方法節約了資源，降低了成本，提高了藥材的利用率，為以后工業化五味子的綜合利用提供了數據支撐。

試驗發現，提油的五味子藥渣醇提取液中，五味子甲素與五味子乙素之間出現了1個新峰，且面積比較大（相對含量比較高），但是其他木脂素類物質的峰數并沒有減少，且面積也未發生顯著差異，說明這種物質不是木脂素類成分間異構化造成的，可能是因為水蒸氣蒸餾溫度高，且時間長，導致熱穩定性差的其他類物質結構發生轉化而生成，該物質具體的結構和性質有待于后續分離單體，或通過液-質連用技術進一步研究。

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