9種植物粗提總黃酮的體外降脂及抑制非酶糖基化的活性

李楠+許文鳳+葉振南+等

摘要：為了研究9種植物粗提總黃酮的體外降脂及抑制非酶糖基化的活性，分別將9種植物樣品經粉碎、脫脂、脫色處理后，用超聲輔助70%乙醇浸提，真空過濾濃縮后得粗黃酮。以蕓香苷為標準樣品，用紫外分光光度法測其在 510 nm 處吸光度并繪制標準曲線，計算樣品中黃酮含量。隨后進行體外降脂試驗，通過比較有無抑制劑（提取液）加入的情況下，脂肪酶的活性差異、所得各提取物對脂肪酶的抑制率，比較降脂活性大小。之后進行體外非酶糖基化試驗，1 mL 提取液（加氨基胍做陽性對照，加水做陰性對照）與 1 mL 磷酸緩沖液混合，90 ℃水浴 40 min；然后與乙二醛和牛血清白蛋白混合，反應液于 37 ℃條件下孵育 15 d，用熒光法在發射波長 440 nm 激發波長 365 nm 處測定糖基化產物的自發熒光值，計算9種植物粗提黃酮對體外非酶糖基化反應的抑制率，結果表明9種植物黃酮粗提物對脂肪酶均有較強的抑制作用，其中蛇接骨草抑制活性最強。在體外非酶糖基化試驗中，9 種植物對非酶糖基化終產物的生成均有較強的抑制作用，其中蘆薈黃酮非酶糖基化抑制活性最強。

關鍵詞：黃酮；降脂活性；抑制；非酶糖基化

中圖分類號： R284.1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0291-03

收稿日期：2013-09-24

基金項目：國家自然科學基金（編號：31160319）；江西省高等學校科技落地計劃（編號：KJLD13027）；江西省教育廳科技計劃（編號：GJJ13281）。

作者簡介：李楠（1989—），女，內蒙古滿洲里人，碩士研究生，研究方向為分子營養學。E-mail：296875131@qq.com。

通信作者：王文君，博士，教授，研究方向為食品化學與分子營養學。E-mail：wwjun9999@sina.com。黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物體內具有C6—C3—C6 基本骨架的化合物，已發現的黃酮類化合物有9 000多種[1]。它是生物體內除蛋白質和核酸以外的一類重要生物分子，尤其是一類重要的信息分子，具有多種多樣的生物功能。現代研究證明黃酮類化合物具有擴血管、降血脂、抗凝血、抗炎、抗腫瘤、鎮痛以及非酶糖基化等廣泛的藥理活性[2]，因此成為目前重點研究的植物化學成分之一。

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，是由于胰島素缺乏或相對缺乏而形成持續性高血糖癥。這種持續性的高血糖癥可以導致一些組織器官的代謝異常，產生功能障礙及形態的異常，從而引發眾多慢性并發癥。目前認為在高血糖的情況下，機體組織的許多重要蛋白質發生非酶糖基化反應是糖尿病慢性并發癥的主要發病機制之一[3-4]。非酶糖化反應是蛋白質和葡萄糖在體內發生酶促反應形成 Schiff 堿和Amadori產物等早期產物，進而經過氧化、重排、交聯等過程，形成不可逆的非酶糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）的一系列復雜反應。有效控制高血糖，尋找干預非酶糖基化過程的措施，減少糖基化終末產物的形成是防治糖尿病慢性并發癥和其他老年性疾病的一個可行且有效的方法。抑制蛋白質非酶糖基化已成為藥物開發的一個重要靶點[5-7]。醫學藥物學研究證實氨基胍可以有效抑制蛋白質的糖基化反應[7]。黃酮類化合物對人體具有多種潛在的生物活性，如抗癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗衰老、增強免疫力、防治心腦血管系統疾病和呼吸系統疾病等，且對 AGEs 的生成也有一定抑制作用。

青錢柳（Cyclocarya paliurus）、銀杏（Ginkgo biloba）、綠茶（Camellia sinensis）、蘆薈（Aloe vera var. chinensis）、荷葉（Folium nelumbinis）、蛇接骨草（Gynura procumbens）、菝葜（Smilax china）、魚腥草（Houttuynia cordata）、三葉草（Trifolium repens）等9種植物都屬于自然中常見的實用性較強的天然植物，有些還是藥食同源植物。本研究探討了9種植物粗黃酮的體外降脂活性和其對非酶糖基化的抑制作用，以期為其藥用價值的開發利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

青錢柳、銀杏、綠茶、蘆薈、魚腥草、荷葉、蛇接骨草、菝葜、三葉草，都來源于江西農業大學植物園。

1.2主要試劑

氫氧化鋁、聚乙烯醇、三油酸甘油酯、乙二醛均購自天津永大化學試劑，胰脂肪酶、氨基胍和標準牛血清白蛋白購自 Sigma 公司。

1.3主要儀器

電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；RE-52A 旋轉蒸發器（上海亞榮生物化儀器廠）；SHE-III 型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；SP-754PC 型分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；960 型熒光分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；KQ3200DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-6 電熱恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.4試驗方法

1.4.1黃酮的提取植物烘干至恒重后粉碎過 70 目篩，稱取 100 g 用石油醚按料液比1 g ∶10 mL浸提過夜脫脂脫色，蒸干備用。準確稱取處理后樣品50 g，超聲輔助70%乙醇浸提（料液比1 g ∶10 mL，70 ℃，60 min，100 W），真空過濾后，將濾液進行真空濃縮至約20 mL，得總黃酮粗提取物。用70%乙醇將粗提黃酮定容至100 mL容量瓶得樣品總黃酮溶液，再從100 mL中取5 mL溶液用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中為備用液。

1.4.2體外降脂試驗降脂試驗根據霍世欣等的方法[8]稍有修改。脂肪酶催化脂肪分解，生成脂肪酸，以酚酞作指示劑，用 0.05 mol/L NaOH 溶液滴定。通過比較有無抑制劑（提取液）加入的情況下，脂肪酶活性的差異，可得提取物對脂肪酶的抑制率，體現降脂活性的大小，并與含量進行相關性比較。endprint

抑制率=抑制脂肪酶活性/脂肪酶活性×100%（1）

脂肪酶活性測定法：取 100 mL 三角瓶，加入 5 mL 0.025 mol/L 磷酸緩沖液（pH值7.4）和 4 mL 聚乙烯醇三油酸甘油酯乳化液（0.22 g/mL 聚乙烯醇，油酸甘油酯 1 mL 混合，高速攪拌均勻，得乳白色乳化液）作為底物，置于 37 ℃水浴中反應 10 min。加入 1 mL 脂肪酶（2 mg/mL），準確反應 15 min 后，加95%乙醇終止反應。加酚酞 2 ～3 滴，用 0.05 mol/L NaOH 標準溶液滴定至微紅色，平行試驗3次。空白試驗的酶液在反應終止后加入。

1.4.3糖基化試驗在蛋白質非酶糖基化反應體系中加入粗提黃酮進行藥物干預試驗，分別于1、3、6、9、12、15 d用熒光分光度計測定熒光值，繪制動態曲線，加氨基胍作陽性對照，加水作陰性對照，進行抑制能力分析；以氨基胍作參比，計算粗提物對非酶糖基化終末產物的抑制率，并與含量進行相關性分析。具體試驗過程如下：

（1）反應液配制：根據文獻[9]的方法稍加修改，將乙二醛（GXL）12 mg/mL、牛血清白蛋白（BSA）20 mg/mL和EDTA 1 mol/L，在pH值7.4的磷酸緩沖液（PBS）0.2 mol/L中混合而成，備用。

（2）蛋白質非酶糖基化的藥物干預試驗：根據文獻[10]的方法稍加修改，將提取液1 mL（濃度為1 mg/mL）與PBS 1 mL 在90 ℃下混合，40 min（以去除乙醇）后加入反應液 1 mL，分別于37 ℃ 水浴避光孵育1、3、6、9、12、15 d，重復3次。氨基胍1 mL（0.1 mg/mL）與反應液做陽性對照，蒸餾水 1 mL 與反應液作空白對照。

（3）抑制率的測定：根據糖基化終產物有自發熒光的特性，采用熒光法測定熒光值，將抑制率與含量進行相關性分析。測定條件：激發波長365 nm，發射波長440 nm[11]，狹縫10 nm，靈敏度1。

I=（B-A）/A×100%（2）

式中：I為抑制率，A為空白對照熒光強度，B為樣品熒光強度。

2結果與分析

2.1體外降脂試驗測定結果

蛇接骨草提取物的體外降脂效果最好，抑制率達到72.57%，最低的是荷葉，抑制率僅為 30.64%，兩者差異極顯著（P<0.01），其他植物的抑制率依次為蘆薈>綠茶>三葉草>銀杏>菝葜>青錢柳>魚腥草。

種植物粗黃酮降脂效果

樣品抑制率（%）青錢柳36.74±9.77Bbc銀杏47.51±6.85Bb蘆薈66.73±12.7Aa荷葉30.64±8.06Bc蛇接骨草72.57±4.68Aa菝葜41.10±14.06Bbc魚腥草32.39±3.24Bc三葉草64.75±4.10Aa綠茶66.51±1.61Aa注：同列數據后不同大寫字母表示差異極顯著（P<0.01），不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2.2非酶糖基化試驗測定結果

隨著時間的延長，熒光強度逐步增高，各提取物的抑制能力增強。在15 d時，抑制糖基化反應能力最強的是蘆薈黃酮提取物，其抑制率達到95.37%，另外銀杏黃酮達到80.46%、綠茶黃酮達到80.51%，與氨基胍抑制率相當。表29種植物粗黃酮抑制糖基化結果

樣品抑制率（%）1 d3 d6 d9 d12 d15 d青錢柳16.42±4.06**41.39±2.54**53.31±3.24*62.92±2.9267.06±0.6972.72±0.62銀杏13.82±3.85**56.34±3.57*67.59±3.4265.96±4.9374.92±7.3280.46±6.94綠茶13.44±1.66**53.66±3.57*66.14±3.0778.06±4.8178.41±1.6780.51±3.87蘆薈78.43±1.4880.21±1.9686.79±4.3189.07±3.2794.89±1.9295.37±4.21*荷葉21.13±1.52**46.34±3.57**55.93±3.50*64.20±4.4365.87±1.3767.49±3.02蛇接骨草10.37±14.84**14.62±4.79**18.12±14.98**27.18±6.68**37.70±8.26**44.10±3.55**菝葜18.03±6.19**36.45±6.08**55.86±1.14*56.07±3.39*58.02±2.3462.31±2.77三葉草25.30±9.52**26.22±6.81**26.79±1.23**26.90±11.96**27.08±17.42**28.08±9.32**魚腥草20.15±3.45**39.16±2.15**42.56±3.54**50.86±8.06*53.45±9.81*63.15±5.68氨基胍71.72±3.8874.76±4.1280.28±2.4080.36±5.5982.22±6.9484.26±1.95注：與氨基胍相比，*表示P<0.05，** 表示P<0.01。

3討論

本研究黃酮對脂肪酶活性抑制作用測定的方法為滴定法，利用脂肪酶催化脂肪水解為脂肪酸和甘油，再使用標準堿溶液結合指示劑對產物脂肪酸進行酸堿滴定（或直接用pH酸度計代替指示劑），由耗堿量求出脂肪酶的活性。耗堿量少，說明脂肪酸產生量少，推斷脂肪酶活性受到抑制。在本試驗中，加入黃酮試驗組消耗的NaOH少于未加植物黃酮試驗組，9種不同植物中提取的黃酮均對脂肪酶活性有一定抑制作用，能減少體內游離脂肪酸的產生，表明黃酮可能通過抑制脂肪酶活性降低血脂水平，從而在一定程度上能預防心血管等相關疾病。

蛋白質糖基化在糖尿病血管并發癥的發生中占有非常重要的地位。在非酶促條件下，蛋白質、氨基酸、脂類或核酸等大分子物質的游離氨基酸可以與還原糖的羰基經過縮合、重排、裂解、氧化修飾后產生一組穩定的糖基化終產物（AGEs）[12]。研究表明，滲出血管的可溶性蛋白與血管基質成分通過AGEs互相交聯，如血漿低密度脂蛋白（LDL）滲出與血管壁細胞交聯堆積，影響LDL彌散出內膜而產生血管病變。血漿蛋白與腎小球底膜交聯，引起毛細血管基底膜進行性增厚和微血管阻塞[13]。endprint

以往人們對糖尿病的治療重點放在對血糖的控制上，但隨著研究的深入，蛋白質非酶糖基化反應與糖尿病并發癥的關系日益受到人們的重視。體內蛋白質的非酶糖基化反應與很多并發癥的病理機制有關，如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性腎病等。蛋白質非酶糖基化并不會因為血糖得到控制而停止，依然會造成糖尿病慢性并發癥的發生和發展，即所謂的“高血糖記憶”狀態。通過阻斷非酶糖化反應從而防治上述疾病的發生發展是近年來藥物治療學領域研究的新方向[14]。

黃酮具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫調節、降血糖、降血脂等。本研究對 9 種天然植物的黃酮提取物進行了體外降脂和非酶糖基化的研究。發現蛇接骨草、綠茶、三葉草的體外降脂作用比較明顯；而非酶糖基化的研究表明蘆薈對非酶糖基化的抑制率較高，且各種植物黃酮提取物對非酶糖基化的抑制率都隨著時間的延長而增強，與文獻[15]報道一致。盡管體外試驗表明 9 種植物的黃酮具有體外降脂和對非酶糖基化抑制作用，但黃酮對 AGEs 的抑制作用機制目前研究的不是很清楚，還有待進一步研究。

4結論

試驗中9種植物的黃酮提取物均對脂肪酶有一定的抑制作用，綠茶、蛇接骨草、三葉草對脂肪酶抑制率均在60%以上，其余的多在30%～50%之間。這些植物提取物的抗氧化作用機制可能是因為黃酮類化合物能減少自由基的產生和清除自由基，從而抑制脂質氧化。

從非酶糖基化試驗中可以看到，觀察1～15 d的抑制率記錄可發現，隨著時間的延長，各樣品的熒光強度逐步增高，提示各提取物的抑制能力增強。且觀察15 d時的最終抑制率可發現，除了三葉草，其他植物的黃酮提取物均對蛋白非酶糖基化反應具有一定的抑制作用，其中以蘆薈的抑制作用最強，抑制率均達到95%以上。

參考文獻：

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[14]Puddu A，Viviani G L. Advanced glycation endproducts and diabetes：beyond vascular complications[J]. Endocrine，Metabolic & Immune Disorders Drug Targets，2011，11（2）：132-140.

[15]許麗璇，李偉斌，蔡建秀. 川芎總黃酮提取優化及小鼠體外抗氧化作用[J].endprint

以往人們對糖尿病的治療重點放在對血糖的控制上，但隨著研究的深入，蛋白質非酶糖基化反應與糖尿病并發癥的關系日益受到人們的重視。體內蛋白質的非酶糖基化反應與很多并發癥的病理機制有關，如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性腎病等。蛋白質非酶糖基化并不會因為血糖得到控制而停止，依然會造成糖尿病慢性并發癥的發生和發展，即所謂的“高血糖記憶”狀態。通過阻斷非酶糖化反應從而防治上述疾病的發生發展是近年來藥物治療學領域研究的新方向[14]。

黃酮具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫調節、降血糖、降血脂等。本研究對 9 種天然植物的黃酮提取物進行了體外降脂和非酶糖基化的研究。發現蛇接骨草、綠茶、三葉草的體外降脂作用比較明顯；而非酶糖基化的研究表明蘆薈對非酶糖基化的抑制率較高，且各種植物黃酮提取物對非酶糖基化的抑制率都隨著時間的延長而增強，與文獻[15]報道一致。盡管體外試驗表明 9 種植物的黃酮具有體外降脂和對非酶糖基化抑制作用，但黃酮對 AGEs 的抑制作用機制目前研究的不是很清楚，還有待進一步研究。

4結論

試驗中9種植物的黃酮提取物均對脂肪酶有一定的抑制作用，綠茶、蛇接骨草、三葉草對脂肪酶抑制率均在60%以上，其余的多在30%～50%之間。這些植物提取物的抗氧化作用機制可能是因為黃酮類化合物能減少自由基的產生和清除自由基，從而抑制脂質氧化。

從非酶糖基化試驗中可以看到，觀察1～15 d的抑制率記錄可發現，隨著時間的延長，各樣品的熒光強度逐步增高，提示各提取物的抑制能力增強。且觀察15 d時的最終抑制率可發現，除了三葉草，其他植物的黃酮提取物均對蛋白非酶糖基化反應具有一定的抑制作用，其中以蘆薈的抑制作用最強，抑制率均達到95%以上。

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[14]Puddu A，Viviani G L. Advanced glycation endproducts and diabetes：beyond vascular complications[J]. Endocrine，Metabolic & Immune Disorders Drug Targets，2011，11（2）：132-140.

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以往人們對糖尿病的治療重點放在對血糖的控制上，但隨著研究的深入，蛋白質非酶糖基化反應與糖尿病并發癥的關系日益受到人們的重視。體內蛋白質的非酶糖基化反應與很多并發癥的病理機制有關，如糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病眼病、糖尿病性腎病等。蛋白質非酶糖基化并不會因為血糖得到控制而停止，依然會造成糖尿病慢性并發癥的發生和發展，即所謂的“高血糖記憶”狀態。通過阻斷非酶糖化反應從而防治上述疾病的發生發展是近年來藥物治療學領域研究的新方向[14]。

黃酮具有多種生物活性，如抗腫瘤、免疫調節、降血糖、降血脂等。本研究對 9 種天然植物的黃酮提取物進行了體外降脂和非酶糖基化的研究。發現蛇接骨草、綠茶、三葉草的體外降脂作用比較明顯；而非酶糖基化的研究表明蘆薈對非酶糖基化的抑制率較高，且各種植物黃酮提取物對非酶糖基化的抑制率都隨著時間的延長而增強，與文獻[15]報道一致。盡管體外試驗表明 9 種植物的黃酮具有體外降脂和對非酶糖基化抑制作用，但黃酮對 AGEs 的抑制作用機制目前研究的不是很清楚，還有待進一步研究。

4結論

試驗中9種植物的黃酮提取物均對脂肪酶有一定的抑制作用，綠茶、蛇接骨草、三葉草對脂肪酶抑制率均在60%以上，其余的多在30%～50%之間。這些植物提取物的抗氧化作用機制可能是因為黃酮類化合物能減少自由基的產生和清除自由基，從而抑制脂質氧化。

從非酶糖基化試驗中可以看到，觀察1～15 d的抑制率記錄可發現，隨著時間的延長，各樣品的熒光強度逐步增高，提示各提取物的抑制能力增強。且觀察15 d時的最終抑制率可發現，除了三葉草，其他植物的黃酮提取物均對蛋白非酶糖基化反應具有一定的抑制作用，其中以蘆薈的抑制作用最強，抑制率均達到95%以上。

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