利用玉米秸稈制備木霉菌可濕性粉劑

田連生 劉鳳云 沙建

摘要：采用玉米秸稈粉固體發酵法制備木霉菌孢子粉，并利用正交試驗篩選出最佳的固體培養基配比：100%秸稈粉+20%葡萄糖+0.5%（NH4）2SO4+0.02%KH2PO4+150%水。通過木霉菌T21與各助劑的生物相容性試驗和正交試驗，篩選出木霉菌可濕性粉劑配方：50%木霉孢子粉+2%MK20+2%拉開粉+46%高嶺土。制成產品的各項指標均符合Q/BASW 02—2006《木霉菌可濕性粉劑質量標準》。

關鍵詞：木霉菌；生物相容性；可濕性粉劑

中圖分類號： S183；S482.2+92文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0116-03

收稿日期：2013-09-03

基金項目：江蘇省高等學校大學生實踐創新項目（編號：2012JSSPITP4029）。

作者簡介：田連生（1962—），男，河北保定人，教授，從事生物農藥及生物降解方面的研究工作。Tel：（0514）85433018；E-mail：lianshengt@163.com。自1932年Weindling發現木霉菌對植物病原菌具有拮抗作用以來，各國科學家從多方面展開了對木霉菌的生防研究工作[1-4]。木霉菌（Trichoderma spp.）屬半知菌類，具有廣譜性、安全性和很強的適應性，通過營養競爭、重寄生、抗生性以及誘導植物的抗性作用機制[5-6]而對多種植物病原菌如腐霉屬（Pythium）、鐮孢屬（Fusarium）、鏈格孢屬（Alternaria）、絲核菌屬（Rhizhotonia）、葡萄孢屬（Botrytis）等有很強的抑制作用；同時木霉菌能防治多種植物病害，而不會對環境與人類健康造成影響。由于木霉菌具有適應性強、產孢量大、病原菌不易產生抗藥性等優點，目前已被國內外廣泛用于防治植物的真菌性病害。以色列Makhteshim Agan公司開發的以哈茨木霉T39菌株為發酵液的生防制劑（Trichodex），為 25%可濕性粉劑，可以用于防治灰霉病、苗枯病、霜霉病和白粉病等葉部病害及果實在儲藏期的腐爛；在美國，利用哈茨木霉防治由腐霉菌引起的蔬菜根腐病也取得了很好的效果。本研究試圖以玉米秸稈為原料，通過固體發酵制備木霉孢子粉，再配以適量的潤濕劑、分散劑和載體等農藥助劑來研制木霉可濕性粉劑。我國是農業大國，秸稈資源豐富，每年的秸稈產量5.7億～60億t，以廢棄的農作物秸稈為原料既可以降低木霉菌劑的生產成本又可以減少農作物秸稈焚燒而造成的環境污染，從而為農作物秸稈的綜合利用提供了一條新途徑。

1材料與方法

1.1試驗材料

拮抗性木霉菌（Trichoderma spp.）T21，由筆者所在單位從多地采集的土樣中分離、純化后經過與灰霉菌、立枯絲核菌等病原菌的對峙培養篩選得到。

分散劑：MK20、NNO、S50，安陽助劑廠；潤濕劑：拉開粉、十二烷基苯磺酸鈉、MF，邢臺藍天精細化工有限公司；載體：硅藻土、輕質碳酸鈣、高嶺土，安徽碭山助立特農用農藥助劑廠。

1.2種子液培養

取100 mL種子液培養基放入250 mL三角瓶中，滅菌后接入拮抗性木霉菌T21，于25 ℃、180 r/min振蕩培養48 h，作為種子液備用。

種子液培養基（1 L）：2%玉米粉，2%葡萄糖，0.1%（NH4）2SO4，0.1%KH2PO4，補足水至1 000 mL，調節pH值為6。

1.3固體發酵培養基的篩選

以來源廣泛、價格低廉易得的玉米秸稈粉作為固體培養基原料，設計以玉米秸稈粉、水、葡萄糖、無機鹽為影響因子的4因素3水平正交試驗，正交試驗設計見表1。

按照上述正交試驗設計，先稱取10 g秸稈粉（過20目）于250 mL三角瓶中，然后將葡萄糖、無機鹽融入水中，再將溶液放入三角瓶中與秸稈粉混合均勻，滅菌冷卻后接入10%種子液，攪拌均勻后于25 ℃恒溫培養6 d。分別取5 g各處理發酵物，于80 ℃干燥6 h后準確稱取1.0 g放入100 mL帶玻璃珠的三角瓶中，于200 r/min振蕩30 min，用血球計數板測定固體發酵物中的木霉菌分生孢子數。每處理重復3次，按最佳固體發酵培養基的配比進行發酵，制備木霉菌孢子粉。

1.4助劑與木霉菌相容性的測定

由于木霉菌分生孢子為生物活體，因此在篩選各農藥助劑時，除了要考慮各助劑對可濕性粉劑的理化性能外，還應該考慮篩選助劑與分生孢子的生物相容性以及是否對分生孢子的萌發產生影響[7]。

1.4.1菌落生長的測定將PDA培養基加熱融化并放至 40～45 ℃ 時，分別加入一定量的載體、分散劑和潤濕劑，使總濃度達到100 mg/L，然后將培養基倒入培養皿，制成藥物培養基。用打孔器截取直徑為45 mm的T21木霉菌菌塊并接入上述藥物培養基的中央，于25 ℃恒溫培養46 h，用“十”字交叉法測量菌落直徑并記錄。每處理重復3次。并以不加助劑的PDA培養基作為空白對照。

1.4.2孢子萌發測定取適量木霉菌孢子粉，用無菌水配成1.5×103 CFU/L的分生孢子懸浮液，取0.1 mL均勻涂布在上述各藥物培養基表面，于25 ℃恒溫培養50 h，觀察分生孢子萌發形成的菌落數，每處理重復3次；用空白PDA培養基作空白對照。

1.5助劑的配比篩選

木霉菌可濕性粉劑的配制是以木霉菌孢子粉為基礎，再加入適量的分散劑、潤濕劑和載體復配而成的[8-9]。其中分散劑和潤濕劑是2個最主要的助劑，它們的種類和加入量對可濕性粉劑的理化性能、防治效果和穩定性有很大影響。各因素水平的正交設計見表2。

比例（%）B：2%分散劑C：2%潤濕劑D：46%載體130MK20MF硅藻土240NNO十二烷基磺酸鈉 高嶺土350S50拉開粉輕質鈣

通過測定正交試驗中各處理的潤濕時間和懸浮率，篩選出最佳可濕性粉劑所用助劑類型和配方。其中潤濕時間按照GB/T 5451—2001《農藥可濕性粉劑潤濕性測定方法》進行測定，懸浮率按照GB/T 14825—2006《農藥懸浮率測定方法》進行測定。

1.6木霉菌可濕性粉劑的配制

根據正交試驗結果篩選出的最佳配方，分別按比例稱取木霉菌孢子粉、分散劑、潤濕劑、載體，充分混和后用高速氣流粉碎機粉碎成325目大小，再用混合器混勻，按Q/BASW02—2006《木霉可濕性粉劑質量標準》進行產品抽樣檢測，合格后包裝為成品。

2結果與分析

2.1固體發酵培養基的篩選

以價格低廉易得的玉米秸稈粉為固體培養基的主要原料，設計了以玉米秸稈粉、葡萄糖、水、無機鹽為影響因子的4因素3水平正交試驗，測定產孢量。正交試驗結果見表3。

可以看出：各因子對固體發酵物的產孢量影響效果依次為：A>B>D>C。即：秸稈粉含量>含水量>葡萄糖含量>（NH4）2SO4+KH2PO4含量。產孢量最大的組合是A3B2C3D1，此組合不在試驗設計中，但與之部分相同的A3B2C1D3組合的產孢量最高，為為12.90×109個/g，可認為最佳固體培養基（重量比50%）為：100%秸稈粉，20%葡萄糖，0.5%（NH4）2SO4+0.02%KH2PO4，150%水。

2.2菌落生長的測定

在25 ℃恒溫培養箱中培養46 h后用“十”字交叉法測量各處理木霉菌落直徑平均值，見圖1。可以看出，木霉菌T21的生長基本不受拉開粉、MK20和高嶺土的影響，其中拉開粉反而會對木霉菌的生長有一定的促進作用；S50、MF對木霉菌等的生長有一定的抑制作用。研究結果為潤濕劑和分散劑的篩選提供了參考。

2.3孢子萌發的測定

的試驗結果表明：高嶺土、MK20的孢子萌發數與空白對照相比基本無差異，拉開粉對木霉菌T21有一定的促進作用；S50、MF的孢子萌發數明顯低于對照處理。本結果與菌落生長結果一致，表明高嶺土可以作為木霉菌可濕性粉劑的載體，拉開粉可以作為潤濕劑，MK20可以作為分散劑。

2.4助劑的配比篩選

以正交試驗各處理測定的潤濕時間和懸浮率為標準，對各配方進行測定和評價，測定結果見表4。由表4中的極差R（懸浮率）數據可見：影響懸浮率的因素為A>D>C>B，即對懸浮率影響的次序分別為：孢子粉、載體、潤濕劑、分散劑。懸浮率最佳的配比為A2B2C1D2，即40%孢子粉、2% NNO、2%MF、46%高嶺土，但表中無此組合；A2B3C1D2組合的懸浮率可達到60%，但其中的S50對木霉菌生長有抑制作用；此外，A3B1C3D2組合的懸浮率可達586%，與60%差距不大。

極差R（濕潤時間）的數據可見：影響潤濕時間的因素大小分別為A>D>B>C，即對潤濕時間影響的次序分別為：孢子粉、載體、分散劑、濕潤劑。潤濕時間的最佳配比為：A1B3C2D3，即30%孢子粉、2%S50、2%十二烷基磺酸鈉、46%

各處理的正交試驗結果L9（34）

處理號因素ABCD懸浮率

（%）潤濕時間

（s）1111146.5168.52122247.9150.73133339.7200.14212350.3133.15223156.898.26231260.095.47313258.690.08321353.6120.99332151.7131.6K1（懸浮率）134.1155.4160.1155.0K2（懸浮率）167.1158.3149.9166.5K3（懸浮率）163.9151.4155.1143.6R（懸浮率）33.06.910.222.9K1（濕潤時間）519.3391.6384.8398.3K2（濕潤時間）326.7369.8415.4336.1K3（濕潤時間）342.5427.1388.3454.1R（濕潤時間）192.657.330.6118.0

輕質鈣，但表中無此組合；A3B1C3D2組合條件的潤濕時間可達90 s，因此木霉可濕性粉劑的最佳配方選擇A3B1C3D2，即50%木霉孢子粉、2%MK20、2%拉開粉、46%高嶺土。

2.5木霉菌可濕性粉劑的質量檢測

采用Q/BASW 02—2006《木霉菌可濕性粉劑質量標準》對產品進行抽樣檢測，表5結果表明各項指標均符合標準。表5木霉菌可濕性粉劑的檢測結果

類別木霉活孢子數

（個/g）懸浮率

（%）水分

（%）pH值細度（通過44 μm

試驗篩）（%）潤濕時間

（s）加速貯存試驗[（54+2） ℃，14 d]

失活率（%）標準≥2.0×108≥80.05±16.0～7.0≥95≤120≤20.0測量數2.6×10880.156.29611519.8

3結論

經正交試驗篩選出了最佳固體培養基：100%秸稈粉，20%葡萄糖，0.5%（NH4）2SO4，0.02%KH2PO4，150%水。

生物相容性試驗表明：高嶺土可作為木霉菌可濕性粉劑的載體，拉開粉可作為潤濕劑，MK20可作為分散劑，而S50、MF對木霉T21的生長有一定的抑制作用。

助劑配比正交試驗篩選出最佳的木霉可濕性粉劑配方為：50%木霉孢子粉、2%MK20、2%拉開粉、46%高嶺土。

綜合試驗結果，本試驗配制的木霉菌可濕性粉劑各項指標均符合Q/BASW02—2006《木霉菌可濕性粉劑質量標準》。

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