8株白僵菌菌株的抗逆性研究

滕忠才 劉廷輝 張立紅 董建臻 李瑞軍 李保國

摘要：對8個白僵菌（Beauveria bassiana）菌株的抗旱力、耐高溫能力、抗紫外線能力和耐低溫能力等生物學性狀進行了測定，綜合各菌株的生物學特性和對小菜蛾幼蟲的毒力指標，最終得出優良菌株是BD-B026。

關鍵詞：小菜蛾；白僵菌；抗逆性；抗旱力；耐高溫能力；抗紫外線能力；耐低溫能力

中圖分類號： S482.3+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0122-03

收稿日期：2013-12-29

基金項目：河北省科技支撐計劃（編號：12220302D）；河北省現代農業產業技術體系小麥創新團隊項目。

作者簡介：滕忠才（1970—），男，河北獻縣人，碩士，講師，主要從事農業昆蟲與害蟲綜合防治研究。E-mail：teng-zhongcai@163.com。

通信作者：李瑞軍（1967—），男，河北昌黎人，博士，副教授，主要從事害蟲生物防治及農業生態安全研究。Tel：（0312）7528172；E-mail：liruijun99@sina.com。白僵菌作為一種重要的殺蟲真菌，在國外已被開發成為多種劑型并登記注冊[1-3]。隨著近十多年來絲孢類生防真菌制劑技術的不斷發展，長期困擾菌劑本身的生產、加工及應用的很多技術難題都被有效解決[3-5]，使得越來越多的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）制劑用于農林害蟲的防治[4]。雖然能夠寄生多種昆蟲，但不同菌株對寄主有一定的專化性，致病力也有一定的差異[5]，其致病力主要取決于菌株、害蟲蟲態以及環境條件等因素[6]。球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是白僵菌屬中的一種，主要發生于包括鞘翅目和半翅目等絕大多數昆蟲[7]，其有效成分是具有細胞生命特征的侵染體（分生孢子或菌絲體）。白僵菌菌株抗逆性的強弱在很大程度上決定著菌劑本身的生態適應性和田間應用效果。即使同一菌株在不同的寄主上也表現出不同的毒力，不同菌種或同一菌種的不同菌株在抗逆性方面往往存在較大的差異[8]，因而，篩選高毒力且抗逆性強的菌種菌株是提高生防菌劑技術含量和適用性的重要途徑之一。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：對小菜蛾高毒力的白僵菌菌株BD-B007、BD-B008、BD-B001、BD-B021、BD-B010、BD-B029、BD-B017、 BD-B026，均為筆者所在實驗室自主分離。供試試蟲：筆者所在實驗室人工飼養的小菜蛾2～3齡幼蟲。培養基：SDAY固體培養基（葡萄糖4%，蛋白陳1%，酵母粉1%，瓊脂2%）；SDAY液體培養基（葡萄糖4%，蛋白陳1%，酵母粉1%）。營養液：2%的葡萄糖和5%的蛋白胨。

1.2高毒力白僵菌菌株抗旱力的篩選

1.2.1高毒力白僵菌菌株抗旱力的測定取芽生孢子懸液，以SDAY液體培養基為基礎培養基，加入10%的PEG200（聚乙二醇，分子量6 000），在（25±1） ℃下培養，測其萌發中時GT50′；以未加PEG200的菌液為對照，測定其萌發中時GT50。以GT50′與GT50之差作為孢子耐干旱能力的大小，每次測定各菌株設3個重復（萌發液試管3支）。

1.2.2干旱脅迫下高毒力白僵菌菌株生長量的測定取芽生孢子懸液，以SDAY液體培養基為基礎培養基，加入5%、10%、20%、30%、40%的PEG200，以未加PEG200處理為對照，（25±1） ℃下培養12 h，于8 000 r/min離心10 min，棄上清液。孢子用滅菌水洗滌2次，同上離心，用0.05% Tween-80 分別配制成含孢子1×106個/mL的懸液，然后用直徑7 mm的濾紙圓片浸沒于孢子懸液中，再取出置于直徑 9 cm 的SDAY平板中央，然后置于（25±1） ℃的培養箱中連續培養 7 d，每處理重復3次，逐日測量各平板上的菌落直徑。

1.3高毒力白僵菌菌株抗紫外線能力的篩選

將各菌株的芽生孢子懸浮液（40～120個/μL）在室內紫外燈（30 W）下60 cm處照射0、0.5、1、2、4、6 min，吸取上述各處理的孢子懸浮液1 μL，均勻涂布于SDAY平板上，將平板置于 （25±1） ℃ 溫箱中培養，每個處理3次重復。培養 5 d 后計數各處理平板中菌落數，以未經處理的為對照，計算各菌株各處理的菌落死亡率，表示分生孢子的死亡率。

1.4高毒力白僵菌菌株耐高溫能力的篩選

1.4.1短時高溫處理對分生孢子的影響將芽生孢子懸浮液分裝至試管，置于水浴鍋恒溫處理，處理溫度設置：35、40、50、60、70 ℃，處理時間設置：10、20、30、40、50、60 min，以不加溫處理為對照，3次重復。然后將處理的分生孢子分別：（a）轉移至營養液，于26 ℃搖床恒溫培養18～24 h，顯微鏡下觀察5～10個視野，約500個孢子，計萌發率；（b）涂布于SDAY平板，25 ℃培養3 d，計成菌落數。

1.4.2持續高溫培養對分生孢子的影響將芽生孢子懸浮液轉移至營養液，分裝至試管，置于水浴鍋35、40、50、60、70 ℃ 恒溫培養3～4 d，以25 ℃培養為對照，3次重復。涂布于SDAY平板，計成菌落數。

1.5高毒力白僵菌菌株耐低溫能力的篩選

1.5.1高毒力白僵菌菌株低溫下萌發率的測定取芽生孢子懸浮液，轉移至營養液，分裝至試管，在（15±1） ℃下培養，測定其萌發率。

1.5.2各菌株低溫下生長量的測定取芽生孢子懸液 10 μL，滴于SDAY平板中央，每菌株設3個重復，置 （25±1） ℃ 培養7 d，逐日測量菌落直徑。

2結果與分析

2.1高毒力白僵菌菌株抗旱力的篩選

2.1.1高毒力菌株抗旱力的測定由表1可知，經不同濃度PEG200處理后，對不同菌株孢子萌發產生的影響不同。其中BD-B026菌株的抗旱力最高，對其孢子萌發的影響最小；BD-B017菌株次之，對BD-B007菌株影響最大。

2.1.2干旱脅迫下高毒力菌株生長量的測定由表2可知，不同菌株經不同濃度PEG200處理后，對孢子產生的影響隨PEG200處理濃度的增大而增加。當處理濃度為20%時，各

菌株與未經PEG200處理間差異較明顯。當處理濃度為40%時，各菌株之間存在顯著性差異。其中40%PEG200對 BD-B029 的抑制率最高，BD-B021次之，BD-B026最小。表2不同菌株生長抑制率

菌株生長抑制率0%PEG200（CK）5%PEG20010%PEG20020%PEG20030%PEG20040%PEG200BD-B0260.00aA0.00aA0.01abA0.02abA0.03abA0.08bABD-B0100.00aA-0.02aA0.03abA0.01abA0.03abA0.10bABD-B0080.00aA0.00aA0.03aA0.05aA0.12aA0.13aABD-B0010.00aA0.00aA0.02aA0.04aAB0.12bBC0.14bCBD-B0170.00aA0.01abA0.04bcA0.07bcAB0.10cAB0.14dBBD-B0210.00aA0.00aA0.01bcAB0.10cABC0.15cdBC0.17dCBD-B0070.00aA-0.02aA0.00aA0.03aA0.09abAB0.18bBBD-B0290.00aA0.03aA0.05aA0.07aA0.17bAB0.21bB注：同行不同小寫、大寫字母表示差異顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）。

2.2高毒力白僵菌菌株抗紫外線能力的篩選

不同菌株孢子經紫外光照射后，均對孢子產生影響，隨紫外照射時間的增加而增大，且與未經照射孢子的萌發率之間均存在顯著性差異。各菌株孢子間致死中時差異較明顯（表3）。經紫外線照射后，其中BD-B008菌株孢子活率最低，對孢子的影響最大；BD-B007菌株次之，對BD-B17菌株影響最小。

2.3高毒力白僵菌菌株耐高溫能力的篩選

2.3.1短時高溫處理對分生孢子的影響溫度通常關系到白僵菌孢子萌發和菌絲生長的速度，以及致病率的高低。尤其是高溫，35 ℃是白僵菌營養生長的極限溫度[9]。因此，孢子耐熱性能是篩選優良菌株的重要指標之一，耐熱性好表明菌株在野外抵抗高溫的能力強。8個供試菌株經高溫水浴處理后，18～24 h后孢子萌發結果見表4和表5。

菌株致死中時（min）回歸方程BD-B0171.67±0.02 y=1.186 9+3.117 8xBD-B0101.04±0.03y=2.470 0+2.482 9xBD-B0260.77±0.04y=3.461 2+1.736 8xBD-B0290.64±0.04y=3.790 0+1.503 2xBD-B0010.63±0.05y=4.085 6+1.146 8xBD-B0210.58±0.03y=3.033 7+2.577 3xBD-B0070.47±0.03y=3.612 1+2.059 9xBD-B0080.06±0.08y=5.170 4+0.936 6x

2.3.1.135 ℃熱脅迫對分生孢子的影響35 ℃處理后與對照有差異，得到的成菌落數均比觀察到的發芽率略低，但熱處理時間長短對發芽率和成菌落數的影響趨勢基本相同（表4）。表4不同菌株分生孢子經35 ℃恒溫水浴不同時間脅迫處理后的死亡率

菌株死亡率0 min10 min20 min30 min40 min50 min60 minBD-B0260.00aA0.03abAB0.06abcABC0.10abcdABC0.13bcdABC0.16cdBC0.19dCBD-B0170.00aA0.03abA0.11abcAB0.18bcAB0.21bcAB0.22cAB0.29cBBD-B0290.00aA0.08abA0.20abA0.23abA0.28abA0.31bA0.32bABD-B0080.00aA0.11abAB0.16abcAB0.21abcAB0.27bcAB0.33cB0.37cBBD-B0100.00aA0.02aA0.17bB0.23cC0.37dD0.46eE0.55fFBD-B0070.00aA0.10bB0.18cB0.31dC0.46eD0.52eD0.62 fEBD-B0010.00aA0.44abAB0.49abcAB0.52abcAB0.55bcAB0.59cB0.65cBBD-B0210.00aA0.32bB0.38cB0.52cB0.66dC0.69eD0.86fE注同表3。

菌株半致死時間

（LT50）（min）回歸方程BD-B026126.88±0.05y=2.543 5+1.167 9xBD-B01793.85±0.04y=2.516 5+1.259 1xBD-B02953.49±0.02y=0.456 4+2.629 0xBD-B01052.57±0.03y=2.272 1+1.585 3xBD-B00837.34±0.03y=1.986 3+1.916 9xBD-B00736.48±0.03y=2.070 3+1.875 5xBD-B00123.39±0.03y=2.507 6+1.820 6xBD-B02115.77±0.05y=3.491 2+1.259 7x

2.3.1.240 ℃熱脅迫對分生孢子的影響孢子的萌發在此溫度下非常敏感，敏感程度依次為：BD-B026、 BD-B17、BD-B029、BD-B010、BD-008、BD-B007、 BD-B001、 BD-B021（表5）。BD-B021在處理10 min時，發芽率下降了32%。BD-B010和BD-B001對短時熱處理有一定的忍耐力，當處理10 min時，發芽率與對照無顯著差異，BD-B026 與其他菌株比較耐受能力較強，但處理時間為30 min時，發芽率也下降至21%以下。另外，成菌落數均比觀察到的發芽率略低，但熱處理時間長短對發芽率和成菌落數的影響趨勢基本相同。

50 ℃、60 ℃和70 ℃處理對孢子萌發有很大抑制作用，各處理時段的發芽率均為0。

2.3.2持續高溫處理對分生孢子的影響試驗結果表明各菌株在各溫度培養3～ 4 d均未形成菌落。

2.4高毒力白僵菌菌株耐低溫能力的篩選

2.4.1高毒力菌株耐低溫能力的測定結果不同菌株經低溫處理，由于各菌株對低溫的耐性不同，菌株之間存在十分明顯的差異性。經低溫處理48 h，BD-B008菌株孢子的萌發率最高，對孢子的影響最小，孢子萌發一半所需要的時間最短，對BD-B029菌株影響最大，孢子萌發一半所需時間最長。

菌株萌發中時（min）回歸方程BD-B00834.47±0.02y=0.012 7+3.243 9xBD-B01036.15±0.02y=0.347 2+2.986 1xBD-B00737.78±0.02y=-0.139 1+43.258 2xBD-B01738.71±0.02y=0.217 8+3.011 7xBD-B00139.41±0.02y=0.456 3+2.847 7xBD-B02139.89±0.02y=-0.017 7+3.134 4xBD-B02639.01±0.02y=-0.068 7+3.185 5xBD-B02949.40±0.02y=10.461 6+2.679 5x

2.4.2各菌株低溫下生長量的測定結果菌株營養生長快慢是反映菌株優良性狀的指標之一。8個白僵菌菌株在SDAY 培養基上生長有明顯的差異（表7） 。7 d時菌落生長直徑從11～1.4 cm不等，其中菌株BD-B008和BD-B001生長最快，BD-B021生長最慢。表7不同菌株低溫下的菌落直徑

菌株菌落直徑（cm）1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 dBD-B0080.00aA0.56aA0.70aA0.88aA1.05aA1.18aA1.40aABD-B0010.00aA0.55aA0.70abA0.90abA1.00abAB1.20aA1.38abABBD-B0170.00aA0.60aA0.70abcA0.75abcAB0.83bcABC1.20aA1.33bcABCBD-B0070.00aA0.53aA0.65abcA0.73abcAB0.85cdBC0.95aA1.23bcdABCBD-B0260.00aA0.53aA0.75abcA0.78bcAB0.85cdBC1.05aA1.22bcdABCBD-B0290.00aA0.50aA0.60abcA0.70cAB0.80cdBC1.10aA1.20bcdABCBD-B0100.00aA0.53aA0.67bcA0.81cAB0.93cdC1.10aA1.15cdBCBD-B0210.00aA0.53aA0.62cA0.76cB0.85dC0.95aA1.10dC

2.5綜合評判白僵菌菌株的生物學性狀指標

綜合評判8個白僵菌菌株的抗旱能力、耐熱能力、抗紫外線能力和耐低溫能力等生物學指標（表8）。從表8可知，對生物學性狀指標進行綜合評價后，BD-B017、BD-B010和BD-B026分別位列前3位，綜合對小菜蛾的毒力考慮菌株BD-B026為首選開發菌株。表8不同菌株生物學指標綜合評價

菌株抗旱能力抗旱生長

抑制率耐熱能力抗紫外能力紫外生長

抑制率耐低溫能力抗旱生長量綜合排序BD-B017242124318BD-B026181357530BD-B010474242730BD-B007826713431BD-B029313478632BD-B008765861134BD-B021538636839BD-B001657585238

3結論與討論

研究結果表明，不同菌株間抗逆性存在顯著差異，同一菌株對不同條件的抗逆性也不相同。表明白僵菌孢子的穩定性除與溫度、光照和濕度有關，還與孢子自身有關，所以今后在進行抗性育種和環境監測時，必須考慮這些因素，從而可以有效地預測孢子在環境中的宿存時間和數量，為防治策略的制定提供參考依據。綜合考慮各項指標，BD-B017、BD-B010 和BD-B026有較大的生產應用潛力，這3個菌株的抗旱力、抗寒力、耐熱力、抗紫外線能力等生物學特性，綜合

排序位居前列，但菌株BD-B017對小菜蛾幼蟲的毒力相對較低，最終得出防治小菜蛾幼蟲優良菌株是BD-B026菌株。

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