角喙栓蚤蠅減數分裂行為觀察

李翠軍 馮典興 劉廣純

摘要：以精巢和卵巢組織為材料，采用空氣干燥制片法，吉姆薩和硝酸銀分別染色，對角喙栓蚤蠅（Dohrniphora cornuta）減數分裂染色體形態行為進行研究。結果表明：角喙栓蚤蠅染色體的二倍體數目為2n=8，最小的一對染色體著色較深，推測為性染色體，性染色體不存在異型現象。粗線期同源染色體完成配對纏繞在一起，2條性染色體提前完成解螺旋；雙線期分開的同源染色體呈現許多交叉，這些交叉聯結是粗線期非姐妹染色體間發生交換的結果；后期性染色體呈短棒狀先抵達兩側，證實其為端著絲粒染色體，較常染色體移動速度快。該種減數分裂過程中未發現B染色體存在。

關鍵詞：角喙栓蚤蠅；精巢；卵巢；減數分裂；硝酸銀；吉姆薩；染色體

中圖分類號： Q952.6文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0125-04

收稿日期：2014-02-17

基金項目：國家自然科學基金（編號：31071965，81102296）。

作者簡介：李翠軍（1986—），女，遼寧朝陽人，碩士，從事細胞遺傳學研究。E-mail：licuijun816@163.com。

通信作者：劉廣純，教授，從事蚤蠅學研究。E-mail：liugc01@163.com。蚤蠅是雙翅目中較大科之一，是農、林、醫等領域主要害蟲，有些類群在生物防治和法醫鑒定領域發揮重要作用[1]。對蚤蠅染色體結構數量變異、分裂行為和特殊染色體進行研究，揭示其種類演替、進化和種內進化的客觀規律，可為分類系統建立、近緣種區分乃至種下分類問題提供新的方法和技術。目前，已知核型的蚤蠅共6種，分別為蛆癥異蚤蠅（Megaselia scalaris）[2-4]、東亞異蚤蠅（Megaselia spiracularis）[5]、廣東柵蚤蠅（Diplonevra peregrina）[6]、Pseudacteon curvatus、Pseudacteon nocens和Pseudacteon tricuspis[7]。其中，廣東柵蚤蠅二倍體染色體數目2n=8，性染色體雌雄異型，另外5種蚤蠅的二倍體染色體數目均為2n=6，不存在明顯的性染色體異型現象。同型染色體種類的性別可能由雄性因子M決定[8-9]，或由環境刺激決定[10]。本試驗以角喙栓蚤蠅（Dohrniphora cornuta）為試材，對其染色體減數分裂各時期行為特征進行研究，旨在為蚤蠅科系統進化、遺傳防治和分子遺傳學奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

角喙栓蚤蠅由沈陽大學城市有害生物治理與生態安全遼寧省重點實驗室飼養。

1.2方法

1.2.1染色體標本制作參照馮典興等的空氣干燥法[2]。在Ringers液中解剖出蛹期的性腺，移至固定液（甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1）中固定15～20 min，然后置于滴有少許60%冰醋酸的載玻片上解離10 min左右，用解剖針將材料充分攪碎，滴1滴固定液將細胞打散，放于50 ℃的電熱板上使液體迅速蒸干，染色體充分展開固定在玻片上。

1.2.2染色體標本染色將上述處理的玻片標本用 1/10吉姆薩染液（pH值6.8）扣染至少30 min，用蒸餾水沖凈玻片表面的染液，置于室溫下無塵處自然干燥。

1.2.3染色體快速銀染參照Howell等的方法[11]。在 60 ℃ 水浴鍋中避光染色，玻片標本細胞面向上放于有濕濾紙的容器中。在玻片標本有細胞的位置，按2 ∶1的比例滴加50%硝酸銀和明膠顯影液，避光染色5 min左右（玻片呈金黃色為止）。取出立即用溫蒸餾水漂洗染液，小心不要劃掉玻片上的染色體，置于室溫下無塵處自然晾干。

1.2.4染色體的觀察拍照將干燥好的染色體玻片在 Olympus 相差光學顯微鏡下觀察分析，選取分散良好的分裂相拍照。

2結果與分析

精巢形成初期在解剖鏡下顯示為透明的圓點狀，此時制片得到的結果中混雜的有絲分裂相較多。當精巢發育呈橢球形時，有絲分裂相較少，甚至全是精子。因此，選擇精巢從小圓點發育到近橢球形的時期（23 ℃環境下7～8 d），可以較容易得到減數分裂各個時期。同樣情況下雌蛹卵巢制片也可以得到較多的分裂相，但減數第二次分裂過程較難觀察到，得到的分裂相中大部分為減數第一次分裂，還有部分有絲分裂相。

銀染技術可以使核仁形成區（NORs）呈特異性著色，還可以用于著絲粒、中心粒、減數分裂聯會復合體、性泡和染色體軸的研究。本試驗中4對染色體全部著色但沒有明顯的分帶現象，與基本的吉姆薩染色結果相似，遂選精巢染色體減數分裂硝酸銀染色和卵巢染色體減數分裂吉姆薩染色統一描述。

細線期：一團染色體細線散于核仁附近（圖1-a、圖2-a），每根細絲是由復制后的2條姐妹色單體組成。細線期完成后各同源染色體聯會。

偶線期：染色體線狀縮短變粗（圖1-b、圖2-b）。核仁沒有明顯的形態變化，同源染色體聯會，聯會復合體開始形成，每條線狀染色體實際上包含了4條染色體單體，又稱四合體或四聯體。此時仍不能分清性染色體和染色體的條數。

粗線期：同源染色體已經完全配對，常染色體的同源染色體互相緊靠纏繞在一起，呈現3個中間有拐點的長棒狀染色體對和2個短棒狀性染色體。染色體著絲粒位置較集中，染色體臂自著絲粒處向外擺出，2條性染色體獨立存在于著絲粒附近（圖1-c、圖2-c，箭頭所示）。

雙線期：二價體中同源染色體分開，8條染色體中3對常染色體的同源染色體著絲粒處依然緊靠，染色體臂呈現許多交叉（圖1-d、圖2-d，箭頭所示）。染色體交叉聯結在一起的現象，是粗線期非姐妹染色體間發生交換的結果。

終變期：染色體長度、粗細接近中期I染色體，交叉減少，可清晰看到3對常染色體和1對性染色體（圖1-e、圖2-e）。

中期Ⅰ：染色體聚縮程度最大，常染色體邊緣變光滑，此時依稀可見復制后的姐妹染色單體，16條姐妹染色單體兩兩緊靠在一起，呈現8條狀，染色體整齊排列（圖1-f、圖2-f），箭頭示深染的性染色體。染色體形態與有絲分裂中期相似。

后期Ⅰ：同源染色體分向兩側，姐妹染色體單體不再緊靠，常染色體自著絲粒起四臂分開，性染色體呈“八”字形，此時染色體條數最清晰（圖1-g、圖2-g），性染色體移動較快先抵達兩側。

末期Ⅰ：達到兩側的染色體聚集成堆（圖1-h、圖2-h）。仔細觀察，有的細胞狀結構中能見到沒有解聚的染色體輪廓，推測為減Ⅱ間期。

前期Ⅱ：能看到與減Ⅰ粗線期分裂行為相近的染色體，但是此時沒有細胞核結構，只見3條長線狀染色體和聚成一團的性染色體（圖1-i），線狀染色體由結合在一起的姐妹染色單體組成，性染色體聚在一起，不像減Ⅰ粗線期可分清染色體條數。

中期Ⅱ：染色體縮短壓縮到最大程度，4對姐妹染色單體排成一排（側面觀），主溢痕明顯斷裂突出著絲粒端（圖1-j，箭頭所示）。

后期Ⅱ：姐妹染色體漸漸分開，性染色體較常染色體移動得快，先達到兩側（如1-k、圖2-i）。

末期Ⅱ：末期持續時間較短，卵巢中未能觀察到，只見圓形深染的卵細胞。精巢染色體末期并行達到兩端，聚集成簇，輪廓漸近紡錘形（圖1-l），準備形成精細胞。

3討論

角喙栓蚤蠅染色體銀染后，4對染色體全部著色，但沒有明顯的分帶現象。可能的原因是染色體所處時期不利于染色或染色體活潑轉錄區域活性低；或是核仁形成區較小，難以辨別；再有就是標本制備時表面張力過大，致使銀染物質消失。

減數第一次分裂中期與有絲分裂中期染色體形態沒有明顯差別，這與有絲分裂過程存在體細胞配對現象有關；但在減數第一次分裂后期染色體排列較緊密，同源染色體間緊密程度高于有絲分裂后期。

減數分裂一些重要過程主要發生在第一次分裂中，特別是前期Ⅰ。前期Ⅰ的5個時期持續時間不同，持續時間長的容易見到，持續時間短的就很難觀察到，而且各期持續時間的長短隨種類的不同而不一樣。這一現象在卡內里虱蠅[12]、淡色庫蚊[13]和廣東柵蚤蠅[14]減數分裂中均有報道。角喙栓蚤蠅前期Ⅰ的偶線期、粗線期、雙線期較常見，細線期和終變期次之。減數第二次分裂過程持續時間短，很難觀察到，已有蚤蠅減數分裂研究中，僅蛆癥異蚤蠅減數第二次的后期有過報道。本試驗首次對蚤蠅減數第二次分裂過程進行了較完整觀察。

粗線期和后期是觀察染色體的最佳時期。在粗線期，可見3條細長的二價體和1對短小的染色體；減數第二次分裂后期，每側可見3條“V”形染色體和1條短棒狀染色體。從而證明角喙栓蚤蠅染色體數2n=8，由3對中著絲粒染色體和1對端著絲粒染色體組成。對角喙栓蚤蠅染色體進行硝酸銀染色顯示，最短的1對染色體著色較深、致密，并且這對染色體分裂行為有別于其他染色體，在粗線期，這對染色體較其他染色體提前分開；在后期Ⅱ，也較其他染色體移動得快，推測其為性染色體。本試驗未能觀察到雌雄個體性染色體間差別，2條性染色體間差別需通過RAPD、熒光原位雜交等技術近一步研究。在核型已知的蚤蠅中，除了廣東柵蚤蠅性染色體異型外，其他蚤蠅性染色體均不易區分，可能這種性染色體同型現象在蚤蠅科中較普遍。

Wolf等相繼報道M. scalaris和M. spiracularis中除3對染色體之外，還存在類著絲粒元件，即B染色體[5，16-18]，形態類似于著絲粒，不具染色體臂。B染色體的數目在不同物種

間和同一個體不同細胞間以及減數分裂和有絲分裂的各個時期都有所不同，導致它們行為的復雜性。在有絲分裂和減數分裂期間，大多數B染色體是穩定的，并且高度異染色質化，通常不與任何A染色體配對，在細胞中隨機分布，數目變化較大。在減數分裂時B染色體不分離，具有一定的積累和消減機制。通過對角喙栓蚤蠅減數分裂觀察，在4對染色體無論聯會還是染色體分離都正常未受干擾，未發現B染色體存在。

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