草甘膦對耐草甘膦大豆體內莽草酸含量及產量的影響

楊鑫浩，李香菊

(中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193)

轉基因耐草甘膦大豆是種植規模最大的的轉基因耐除草劑作物，2012年種植面積占全球轉基因作物種植面積的52%[1]。大部分商業化種植的耐草甘膦大豆轉入的是cp4-epsp基因，該基因的轉入，使大豆對草甘膦具有耐受性，所以田間可以噴施滅生性藥劑草甘膦除草[2]。草甘膦是一種非選擇性、傳導型莖葉處理除草劑，其作用機理是競爭性抑制莽草酸合成途徑中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)與底物莽草酸-3-磷酸(S3P)的結合，導致植物體內的莽草酸過量積累，阻斷植物芳香族氨基酸的生物合成，最終殺死植物[3]。國內外研究表明，噴施草甘膦后，植物體內莽草酸含量升高，因此，莽草酸積累是植物經草甘膦處理后最早出現的且相對敏感的生理指標[4-5]；陳景超等報道，施用草甘膦后雜草植株體內莽草酸積累量可以反映不同雜草對草甘膦的敏感性，莽草酸積累量越多，植株對草甘膦耐受性越差[6]。國外對耐草甘膦大豆的研究發現，用1/4～1/2草甘膦推薦劑量進行處理，耐草甘膦大豆體內莽草酸無明顯積累[7-8]。但是，對使用高劑量草甘膦處理后耐草甘膦大豆體內莽草酸含量的變化情況國內外少有研究。生產中，草甘膦噴施劑量往往會超過推薦劑量，農民甚至使用 2～3 倍推薦劑量局部定向噴霧。因此，研究高劑量草甘膦處理后耐草甘膦大豆體內莽草酸含量的變化及草甘膦對大豆產量的影響更具有實際意義。06-698 是我國選育的耐草甘膦大豆，有較高增產潛力[9]；MON87701RR2Y為美國孟山都公司選育的耐草甘膦品種，具有高產、優質、抗除草劑、抗蟲特性，這2種耐草甘膦大豆均通過轉入cp4-epsp基因而對草甘膦產生耐受性。本試驗通過研究耐草甘膦大豆噴施不同劑量草甘膦后葉片莽草酸含量的變化，其一，明確莽草酸積累量與大豆對草甘膦耐受性的關系；其二，通過草甘膦使用量與不同大豆材料莽草酸積累量的關系研究，試圖建立一種大豆對草甘膦耐受性評價的早期、快速、不破壞植株的方法，為我國耐草甘膦大豆的商業化種植提供數據支撐

1 材料與方法

1.1 供試材料

大豆材料：耐草甘膦大豆06-698和MON87701RR2Y均轉入cp4-epsp基因，對照分別為常規大豆材料綏農14和A5547。上述材料中 06-698 由內蒙古呼倫貝爾市農業科學研究所提供，綏農14由黑龍江省農業科學院綏化農科所提供，MON87701RR2Y和A5547由美國孟山都公司提供。

儀器及噴霧器械：FA1104 電子分析天平(上海天平儀器廠)；5417R型低溫臺式離心機(德國艾本德公司)；紫外-可見分光光度計 UV2102 C型[優尼科(上海)儀器有限公司]；ASS-4型行走式噴霧塔(國家農業信息化工程技術研究中心)；CO2背負式噴霧器(國家農業信息化工程技術研究中心)。

試劑及藥品：莽草酸(Sigma 公司標樣)；0.1 mol/L 甘氨酸；0.25 mol/L HCl(北京化工廠分析純)；1%HIO4(天津市光復精細化工研究所分析純)；41%草甘膦異丙胺鹽水劑(孟山都公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 網室試驗及田間試驗

1.2.1.1 網室試驗 取未使用除草劑的農田表層土壤過2 mm篩，按3 ∶1混入凱茵營養土(有機質含量≥15%，N、P、K總含量≥0.88%，pH值7.0～7.5)，定量裝入直徑為15 cm的塑料花盆中，加水使土壤含水量為30%。每盆播種10粒大豆種子，播深3.0 cm，播種后將花盆置溫室(20±5)℃下培養。分別于大豆3、5、7張羽狀三出復葉期(3、5、7葉期)置ASS-4型行走式噴霧塔內，噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑，劑量分別為615.0、1 230.0、2 460.0、3 690.0、4 920.0 g a.i./hm2，即1/2、1倍、2倍、3倍、4倍推薦劑量，記為X/2、X、2X、3X、4X，另設清水對照(CK)，其中1 230.0 g a.i./hm2為推薦劑量，每處理重復3次。

1.2.1.2 田間試驗 于2012年5—11月在中國農業科學院植物保護研究所廊坊中試基地暨農業部轉基因植物環境安全監督試驗測試中心(北京)試驗隔離區進行。試驗地為中壤，pH值為8.0，試驗過程中的管理條件及安全措施按NY/T719.3—2003《轉基因大豆環境安全檢測技術規范 第3部分：對生物多樣性影響的檢測》進行。試驗采取隨機區組設計，每處理3次重復，每小區面積20 m2。大豆條播，行距40 cm，株距8 cm，出苗后按常規方式進行田間管理，全小區均為人工除草。

分別于大豆3、5、7葉期用CO2背負式噴霧器噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑，劑量分別為0、615.0、1 230.0、2 460.0、3 690.0、4 920.0 g a.i./hm2。

1.2.2 取樣方法及莽草酸測定 大豆噴施草甘膦后1、3、5、7、9、11 d從每株大豆上剪取一小部分三出復葉，用液氮研磨葉片，稱取磨碎的樣品0.2 g于2.0 mL的離心管中，加入1.0 mL 0.25 mol/L HCl，4 ℃ 12 000 r/min離心20 min，收集上清液，4 ℃冰箱保存待測。

參考Gaitonde等的方法[10-11]，取200 μL上清液，加入2.0 mL 1% HIO4溶液，室溫靜置3 h，加入2.0 mL 1.0 mol/L NaOH并混勻；然后加入1.2 mL 0.1 mol/L甘氨酸，混勻，靜置5 min，于紫外分光光度計380 nm比色，記錄D。每處理重復3次，并重復試驗3次。

1.2.3 大豆生長狀況觀察及產量測定 田間試驗在大豆施藥后1～14 d目測大豆長勢長相，收獲時每小區取2行大豆植株，晾干至籽粒含水量14%以下，測籽粒產量。

1.2.4 數據處理方法 試驗數據采用Excel、SPSS軟件進行分析處理，采用Duncan新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 草甘膦不同劑量對大豆葉片中莽草酸積累量的影響

網室試驗結果表明，于大豆3葉期時噴施 1 230.0 g a.i./hm2草甘膦后，綏農14和A5547常規大豆葉片內即出現莽草酸積累，且其積累量隨用藥后時間的推移逐漸增加，分別在藥后3、5 d時達到峰值，即為2 561.54、2 565.38 μg/g，是處理前的7.17、7.47倍(圖1-A)。隨著草甘膦用量的增加，上述大豆材料葉片內莽草酸積累量增加，即當施藥劑量為 2 460.0 g a.i./hm2時，藥后3、5 d，大豆葉片莽草酸積累量分別為4 830.77、3 415.38 μg/g(圖1-B)。

草甘膦施藥量為1 230.0～3 690.0 g a.i./hm2時，藥后1～9 d，耐草甘膦大豆 06-698體內莽草酸積累量與清水對照相比沒有明顯變化(圖2-A)，MON87701RR2Y也表現同樣趨勢，即噴施草甘膦處理與清水對照莽草酸積累差異不顯著(圖2-B)。用4倍推薦劑量草甘膦處理06-698和MON87701RR2Y后1 d，大豆葉片中莽草酸有一定程度積累，積累量分別為435.26、433.97 μg/g，是處理前的1.41、1.84倍，之后上述材料大豆葉片莽草酸積累量逐漸下降；至藥后9 d，兩材料葉片內莽草酸的積累量與藥前相比差異不顯著(圖2)。田間試驗結果與網室試驗相近，即2個耐草甘膦大豆材料在草甘膦施藥量為X～3X時，莽草酸積累量與清水對照差異不顯著，草甘膦施藥量為4X時，莽草酸積累量在藥后1～3 d升高，之后與清水對照差異不顯著。

2.2 不同葉齡噴施草甘膦后大豆體內莽草酸積累量的變化

在網室盆栽試驗中，分別在大豆06-698的3、5、7葉期噴施4 920.0 g a.i./hm2草甘膦，隨后研究該大豆材料葉片中莽草酸積累量的變化情況，結果見圖3-A。由此可看出，3葉期施用草甘膦的大豆莽草酸積累量與5、7葉期施用草甘膦的大豆相比偏高。但方差分析結果表明，不同葉期施藥，大豆葉片莽草酸積累量差異不顯著。MON87701RR2Y也表現同樣趨勢(圖3-B)。

由圖4可知，田間條件下分別于3、5、7葉期對耐草甘膦大豆06-698和MON87701RR2Y噴施 4 920.0 g/hm2草甘膦后，其葉片中莽草酸積累量的變化趨勢與網室盆栽試驗中的相近，說明在供試的不同葉齡期噴施4 920.0 g/hm2草甘膦并未使耐草甘膦大豆葉片中莽草酸積累量發生顯著變化。噴施其他低劑量草甘膦后，耐草甘膦大豆葉片中莽草酸積累量的變化趨勢相同。但是，田間試驗測得的耐草甘膦大豆葉片中莽草酸積累量和莽草酸峰值出現的時間與網室盆栽試驗略有差異，這可能與田間較為復雜的環境條件有關。

2.3 噴施草甘膦對大豆產量的影響

由表1可以看出，在3～7葉期噴施不同劑量草甘膦后，06-698和MON87701RR2Y耐草甘膦大豆產量與對照差異不顯著(P>0.05)。說明耐草甘膦大豆噴施草甘膦后，若葉片莽草酸積累量與對照差異不顯著，則噴施草甘膦不會造成減產；噴施較高劑量草甘膦后，雖然大豆葉片莽草酸積累量前期有一定增加，但如果莽草酸短期能夠恢復至藥前水平，則大豆產量也不會受到影響。常規大豆在噴施X劑量草甘膦后，莽草酸積累量急劇增加且一直維持在較高水平，藥后2周內基本死亡，無經濟產量。

表1 不同葉齡期噴施草甘膦對耐草甘膦大豆產量的影響

3 結論與討論

網室盆栽和田間條件下用草甘膦處理耐草甘膦大豆和常規大豆，這2種大豆葉片中莽草酸積累量差異顯著。與不用藥空白對照相比，用1 230.0～2 460.0 g a.i./hm2草甘膦處理后的耐草甘膦大豆06-698、MON87701葉片莽草酸積累量均未顯著增加，而常規大豆綏農14和A5547葉片中的莽草酸積累量在1 230.0、2 460.0 g a.i./hm2草甘膦處理下急劇增加，之后一直保持在很高水平直至枯萎死亡。田間條件下的試驗結果與盆栽結果相一致，這是因為受體大豆綏農14、A5547在噴施草甘膦后，其EPSPS酶受到抑制，導致莽草酸大量積累，而 06-698 和MON87701RR2Y則由于轉入了不敏感的epsp基因使得芳香族氨基酸的合成繼續進行，體內莽草酸積累量基本沒有變化。這與Singh等報道的“普通大豆草甘膦處理后莽草酸積累量快速增加，而耐草甘膦大豆莽草酸積累量在低劑量307.5 g a.i./hm2草甘膦處理下基本不變”的結論[8]一致。

盆栽試驗中耐草甘膦大豆MON87701RR2Y和06-6983在不同葉齡期噴施615.0～3 690.0 g a.i./hm2草甘膦，其葉片莽草酸積累量基本沒有變化，表現出對草甘膦很強的耐受性。在 4 920.0 g a.i./hm2草甘膦處理下，這2種大豆在藥后1～3 d出現莽草酸短暫積累峰值，但很快趨于平穩，這期間目測到大豆葉片有發黃現象，之后隨大豆生長癥狀逐漸緩解。田間條件下的試驗結果與盆栽試驗莽草酸變化趨勢相同，但田間試驗條件下的大豆在不同葉齡期施藥后，葉片莽草酸最大積累值出現的時間偏晚于盆栽試驗，莽草酸總積累量也略有差異，這可能與田間復雜而多變的環境有關，如干旱，高溫均會對耐草甘膦大豆體內EPSPS酶表達產生影響，從而影響莽草酸的積累[12-13]。盆栽及田間試驗結果均顯示，耐草甘膦大豆在3～7葉期對草甘膦耐受性沒有明顯差異，均表現出對1、2倍推薦劑量草甘膦很強的耐受性和對4倍推薦劑量草甘膦較強的耐受性，大豆測產結果也表明不同時期施藥和不同處理劑量下的大豆產量與空白對照差異不顯著。

本試驗以施用草甘膦后大豆葉片莽草酸積累量為指標，對大豆耐草甘膦的程度進行研究，結果表明，施用草甘膦后，可以通過測定大豆葉片的莽草酸積累量來評估大豆對草甘膦的耐受性，其測定時間以藥后3～5 d為宜。如果藥后3～5 d，大豆葉片中莽草酸積累量與不用藥空白對照差異不顯著，則表明該大豆材料對草甘膦有較好的耐受性。以往主要采用生物測定方法來測定作物對草甘膦的耐受性，即在作物生長期噴施不同劑量草甘膦，以作物的株高、鮮質量等生物學指標的受抑制程度來判定其對草甘膦的耐受性，但這種方法歷時較長，得出結論較晚；而且株高、鮮質量等指標常受環境的影響，造成個體生長量的差異。莽草酸積累量的測定，將為大豆的草甘膦耐受性檢測提供一種簡便、易行和不破壞整株植物的耐受性測定方法，對準確評價大豆對草甘膦的耐受性有重要意義。

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