利用小動物SPECT/CT和99m锝-葡糖二酸評估急性缺血壞死心肌動物

寶璐爾，張 林,2,3，周曉慧,2,3，孟慶姝,2,3，占貞貞,2,3，范慧敏,2,3

(1.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院心臟外科，上海 200120；2.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院心衰專科，上海 200120；3.同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院心衰研究所，上海 200120)

近些年來，急性心肌梗死在世界范圍內(nèi)一直是威脅人類健康的重大疾病，快速而及時地評估急性心梗后的缺血壞死心肌的位置和范圍對于治療心梗和評估預(yù)后具有重要意義。葡糖二酸(glucarate，Glu)是一種存在于哺乳動物體內(nèi)組織與體液中，由葡萄糖代謝生成的六碳原子的雙羧基酸[1]。Glu易于和具有放射性標記作用的高锝酸鹽結(jié)合形成99mTc-Glu復(fù)合物，一些研究發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu在急性缺血梗死的心肌組織與壞死的腦組織中會發(fā)生聚集，攝取率升高[2-3]。C. Arteaga等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)在用異丙腎上腺素注射18 h后可以在大鼠體內(nèi)心肌的99mTc-Glu攝取率是正常大鼠心肌攝取率的6倍。在人的體內(nèi)急性梗死后也會出現(xiàn)在梗死區(qū)99mTc-Glu聚集現(xiàn)象[5]。很多的研究都已經(jīng)證實了99mTc-Glu在缺血壞死的心肌組織中會發(fā)生聚集，但是通過SPECT/CT圖像融合技術(shù)和99mTc-Glu示蹤劑是否可以準確地評估急性心梗后缺血壞死心肌的位置和范圍大小尚不清楚。本研究在大鼠的心肌缺血/再灌注的動物模型的基礎(chǔ)上，通過SPECT/CT圖像融合技術(shù)分析99mTc-Glu標記的心肌組織的位置和面積，并與TTC染色法的結(jié)果進行比較，探討通過99mTc-Glu和SPECT/CT融合技術(shù)來評估急性心梗后缺血壞死心肌的位置和范圍大小的可行性和準確性。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，12周齡，體重220 ± 15 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供【SCXK(滬)2013-0016】，飼養(yǎng)條件與實驗操作均符合科技部與同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院實驗管理委員會的要求。大鼠隨機分成手術(shù)組(n=6)和正常組(n=6)，無菌手術(shù)在同濟大學(xué)SPF級動物房進行【SYXK (滬) 2009-0022】。

1.2 實驗操作

1.2.1 大鼠心肌缺血再灌注模型的制作

1.2.1.1 術(shù)前準備

大鼠稱重后按體重給予1%戊巴比妥鈉(pelltobarbitalum natricum)溶液0.4～0.5 mL/100 g體重腹腔注射，注射前回抽，確定無回血。待大鼠進入麻醉狀態(tài)后將其固定在操作臺保溫板上，保持其溫度為37℃。

1.2.1.2 輔助呼吸

大鼠頸部去毛后，將皮膚切開后分離氣管，用24G靜脈留置針的軟管部分進行氣管插管。呼吸機設(shè)置為容量控制模式，潮氣量為2.5～3.5 mL/100 g體重，呼吸頻率60～70次/ min，呼吸比1∶1，吸入氣體為空氣。

1.2.1.3 冠脈左前降支(left anterior descending artery, LAD)結(jié)扎和再通

胸腹部去毛消毒后依次剪開皮膚，深、淺筋膜，沿胸大肌肌間隙鈍性分離胸大肌、胸小肌，在左肋第3、4肋間鈍性分離肋間肌，暴露胸腔，剝離心包膜，在左心耳與右室流出道交界處下方1～2 mm處進針，8-0無損傷縫合線進行結(jié)扎，可見結(jié)扎血管下方心肌組織變蒼白。1 h后將結(jié)扎LAD的縫線去除。

1.2.1.4 關(guān)胸，術(shù)后處理

逐層縫合后用注射器將胸腔內(nèi)多余氣體抽出，關(guān)胸后待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定后氣管拔管，縫合。腹腔注射40萬單位青霉素預(yù)防感染，術(shù)后注意保暖。

1.2.2 顯像儀器和方法

IR手術(shù)24 h后給予大鼠1%戊巴比妥鈉(pelltobarbitalum natricum)溶液0.4～0.5 mL/100g體重腹腔注射麻醉，將99mTc-Glu 2 mCi/只經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)，然后將大鼠放入小動物SPECT/CT(Nanoscan)中進行核素掃描，采集點為99mTc-Glu注射后30 min。

1.2.3 心肌組織TTC染色

將經(jīng)過小動物SPECT/ CT對99mTc-Glu活性掃描的大鼠處死后，取出心臟，生理鹽水沖洗后垂直于心臟長軸將心臟切片，1～2 mm厚，將心臟切片置于1 g TTC/100 mL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)溶液中，避光，振蕩，37℃恒溫染色15～20 min，4%多聚甲醛(PFA)固定10 min后顯微鏡下拍照。

1.3 主要分析指標

1.3.199mTc-Glu掃描

于99mTc-Glu尾靜脈注射30 min后采集圖像，檢測99mTc-Glu在大鼠體內(nèi)的放射性攝取，SPECT和CT三維圖像進行同機融合并分析放射性攝取率偏高區(qū)的位置和范圍大小。

1.3.2 TTC心肌組織染色

TTC可與正常組織中的脫氫酶(NADH)反應(yīng)而呈紅色，而壞死組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，故不會產(chǎn)生變化呈蒼白色。因此TTC染色被廣泛用于區(qū)分活性組織和失活組織。TTC染色后使用imageJ軟件測量心肌缺血壞死范圍。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù) ± 標準誤，兩組間采用 T檢驗(T Test)進行比較分析。線性計算公式為y=0.706x + 0.025。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

手術(shù)組與正常組所有大鼠均未出現(xiàn)死亡或其他影響實驗結(jié)果的因素，實驗過程中及結(jié)束后大鼠均狀態(tài)良好，呼吸和心跳平穩(wěn)。

2.2 99mTc-Glu在急性心梗后的心肌組織中聚集

正常組可見99mTc-Glu在心臟的攝取率同肝臟無明顯差別，心/肝比值為1.14 ± 0.21；IR手術(shù)組可見99mTc-Glu在心臟的攝取率明顯高于肝臟，心/肝比值1.90 ±0.33；手術(shù)組心臟99mTc-Glu攝取率明顯高于對照組(P< 0.05)(圖1，彩插4圖2和圖3)。手術(shù)組心肌掃描可見明顯攝取率偏高的區(qū)域，高攝取率區(qū)域位置與被阻斷冠脈的血供區(qū)域高度吻合(彩插4圖2和圖3)。

圖1 正常組與手術(shù)組99mTc-Glu放射性攝取的心/肝比值

2.3 TTC染色法顯示缺血壞死心肌

正常組大鼠心肌組織切片后TTC染色可見整體心肌組織為紅色，未見白色壞死區(qū)域。手術(shù)組大鼠心肌組織切片TTC染色后可見明顯的壞死后顯白色區(qū)域，壞死區(qū)域為被阻斷冠脈所供血區(qū)域(彩插4圖4)。

2.4 99mTc-Glu標記的心肌組織與小動物SPECT/CT染色顯示的缺血壞死心肌的位置和范圍高度吻合

通過小動物SPECT/CT融合技術(shù)得到的99mTc-Glu高聚集的心肌組織的位置和TTC染色法顯示的缺血壞死心肌位置高度一致(彩插4圖2，圖3和圖4)。通過小動物SPECT/CT融合技術(shù)分析的99mTc-Glu高聚集心肌組織的范圍為30.92 ± 7.72%。心肌組織TTC染色后測得壞死心肌范圍為24.42 ± 5.5%。兩種檢測方法測得壞死心肌范圍數(shù)據(jù)無明顯差異(P>0.05)，更重要的是線性相關(guān)分析顯示兩組數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義的線性相關(guān)性(R2=0.964)(圖5)。

圖5 小動物SPECT/CT與TTC染色測得壞死心肌范圍呈線性相關(guān)

3 討論

在本研究發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu在急性缺血壞死心肌處特異性聚集，通過小動物SPECT/CT技術(shù)可以將99mTc-Glu功能顯像和三維心臟CT圖像融合在一起，從而定位和定量分析99mTc-Glu高富集的熱點區(qū)域，該熱點區(qū)域與TTC染色顯示的缺血壞死心肌區(qū)域高度吻合。這些結(jié)果證實,99mTc-Glu是優(yōu)先沉積于急性心肌損傷后的缺血壞死心肌，更重要的是，通過99mTc-Glu和SPECT/CT同機融合技術(shù)可以實現(xiàn)無創(chuàng)性、實時性以及定量評估急性心肌損傷的嚴重程度。

Brian D等[6]對99mTc-Glu顯示的缺血壞死的心肌進行了組織化學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu聚集處的心肌細胞絕大部分為壞死細胞，只有少量的細胞為凋亡細胞。David R等[7]將大鼠分為了4組：對照組，短暫缺血再灌注組(血管阻斷20 min后再灌注5 min)，低流量再灌注組(心臟保持低灌注狀態(tài)4 mL/ min 120 min)以及完全缺血再灌注組(120 min無血流供應(yīng)后再灌注)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu只有在完全缺血再灌注組大鼠的心臟內(nèi)出現(xiàn)特異性的聚集，證明99mTc-Glu只有在受到損傷無法恢復(fù)而壞死的心肌中特異性的聚集。Zhonglin Liu等[8]將大鼠的冠脈左前降支阻斷后，對比了心肌不同時長的缺血-再灌注損傷后99mTc-Glu的聚集情況，發(fā)現(xiàn)阻斷90 min的大鼠心臟99mTc-Glu富集要明顯多于左前降支阻斷30 min與阻斷60 min的大鼠。

99mTc-Glu的嗜壞死細胞性與細胞壞死后其中的線粒體結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致其內(nèi)的鈣離子釋放有關(guān)，由于其分子量很小，可以迅速的通過細胞膜擴散，所以在組織低血流灌注時也可以與組織細胞進行快速的反應(yīng)，但是在急性缺血再灌注損傷的早期99mTc-Glu檢測可能并不會有明顯的改變[4]，所以進行99mTc-Glu檢測急性缺血再灌注損傷的時間點選擇很重要。Othani, H等[9]在對大鼠冠脈左前降支進行結(jié)扎后10 d內(nèi)連續(xù)注射99mTc-Glu，并收集放射性核素在3 h，24 h，72 h和7～10 d后的圖像，結(jié)果顯示在缺血再灌注后3 h的引起的心肌損傷最嚴重，但是在24 h大部分的大鼠心臟組織內(nèi)有明顯的99mTc-Glu富集，缺血再灌注后7～10 d心臟內(nèi)無明顯的99mTc-Glu富集，這一結(jié)果與我們的研究結(jié)果相吻合。Khaw, BA等[10]認為99mTc-Glu在壞死心肌中的富集以及在血液中可以被快速的清除使得心肌與背景的攝取率差異很大，使得99mTc-Glu在心肌壞死部位的富集可以在影像上顯現(xiàn)，他們的研究也顯示在心肌梗死后24 h左右99mTc-Glu的富集最為明顯。Gerald等[11]的研究發(fā)現(xiàn)在狗的心臟缺血再灌注損傷后4 h后，局部組織再灌注維持在最低限度時雖然99mTc-Glu的攝取率較完全再灌注有一定的延遲，但是依然可以明確的檢測到損傷壞死的心肌，所以說99mTc-Glu可以用于早期低灌注情況下心肌損傷的檢測。但是，關(guān)于檢查的最佳時間點還需要進一步的研究。

在臨床上部分急性心肌梗塞很難診斷，它可能癥狀不典型，甚至沒有胸痛，早期診斷和早期治療可以挽救受損的心肌和避免不必要的溶栓治療帶來的風險。Strauss, HW等[12]以及Gerson和McGoron等[13]在人體上的實驗研究發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu在人體心臟內(nèi)的聚集在心肌壞死發(fā)生后1 h，但是在影像上表現(xiàn)要有2～18 h的延遲，或者在病人情況穩(wěn)定或者病情得到控制后影像上才會有表現(xiàn)，該方法在臨床上的應(yīng)用還有待進一步研究。

99mTc-Glu的嗜壞死細胞性使得它不僅可以在缺血壞死的心肌與腦組織富集，還可以被用來發(fā)現(xiàn)腫瘤性壞死。Perek N等[14]在對白血病腫瘤細胞系U937進行了體內(nèi)與體外的實驗后發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu 會在壞死的細胞上富集，明顯多于凋亡的細胞以及活細胞。99mTc-Glu主要聚集在壞死細胞的細胞核碎片上，而在活細胞與凋亡細胞中則主要分布在細胞質(zhì)與細胞膜上。Gambini JP等[15]將人類乳腺癌細胞移植到免疫缺陷小鼠的體內(nèi)后進行了SPECT/CT檢測，發(fā)現(xiàn)腫瘤區(qū)域的99mTc-Glu攝取率明顯高于其他組織。臨床試驗中，Gambini JP[16]對11例頭頸部惡性腫瘤的病人注射99mTc-Glu后進行SPECT/CT檢測，發(fā)現(xiàn)99mTc-Glu富集區(qū)與其他影像學(xué)顯示的腫瘤區(qū)域相吻合，證明99mTc-Glu可以作為追蹤腫瘤的標志物之一。Partha S等[17]對29例肺癌和18例頭頸癌的患者進行99mTc-Glu的SPECT/CT檢測后發(fā)現(xiàn)在目標區(qū)域有明顯的99mTc-Glu聚集。說明無論在實驗動物還是人體內(nèi)，99mTc-Glu都可以作為一種追蹤腫瘤的標志物。

總之，99mTc-Glu檢測急性缺血壞死心肌是一種快捷而簡便的檢測方式，本研究顯示，在大鼠模型實驗中，99mTc-Glu的放射性很穩(wěn)定，并可以特異地在缺血壞死的心肌處聚集，通過SPECT/CT融合技術(shù)將功能顯像和解剖三維圖像結(jié)合在一起可以無創(chuàng)性地定量分析缺血壞死心肌的位置和范圍，該技術(shù)有希望成為一種臨床上早期評估急性缺血壞死心肌的新方法。

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