達瑪烷苷元對睡眠干擾所致小鼠學習記憶障礙的改善作用

卜蘭蘭, 石 哲，武宏偉，盧 聰、王克柱，李瑩輝，曲麗娜，劉新民

(1.湖南中醫藥大學 病理學教研室，湖南，長沙 410208；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中國航天員中心航天醫學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094；4.湖南省實驗動物中心 湖南省藥物安全評價研究中心，湖南 長沙 410331)

人參是現代藥理研究最多和最充分的傳統中藥之一，而以改善各種學習記憶障礙的研究報導最多。現代研究證明人參皂苷為人參的主要活性成分，對神經系統有多種調節作用，如改善學習記憶障礙、抗抑郁、鎮靜安神、興奮中樞等。研究表明，人參皂苷Rg1、Rb1能改善多種學習記憶障礙模型動物的學習記憶障礙[1-3]，保護多種條件下的神經細胞損傷和凋亡[4-6]。本實驗室前期研究也發現，人參皂苷Rg1、Rb1對睡眠干擾大鼠認知能力有改善作用，人參皂苷Rg1、Rb1、Rh1、PPT對東莨菪堿模型小鼠認知能力有改善作用[7,8]。本實驗旨在通過研究人參苷元類化合物DS-1226對睡眠干擾致認知障礙小鼠學習記憶能力的影響，為改善睡眠障礙致學習記憶損害的藥物研究提供參考。

1 材料

1.1 藥物

DS-1226，dammarane sapogenins，成分：原人參二醇[20(S)-aglycone protopanaxadiol, aPPD]，原人參三醇[20(S)-aglycone protopanaxatriol, aPPT]，人參皂苷Rh2(ginsenoside Rh2)，PAM120等。成分含量：aPPD >12%，aPPT >26%，Rh2 >8%。由加拿大天馬藥業集團惠贈。

1.2 動物

ICR小鼠，雄性，5-6周齡，體重22±2 g，130只，SPF級，購自軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號[SCXK-(軍)2007-004]。使用合格證號：[SYXK( 京) 2003-0009]。

1.3 儀器

小鼠自主活動實時檢測分析處理系統、小鼠Morris水迷宮計算機自動控制和圖像分析處理系統、小鼠避暗實驗檢測系統、滾筒式大小鼠睡眠干擾儀均由中國航天員科研訓練中心和中國醫學科學院藥用植物研究所聯合研發。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

2.1.1 分組：采用隨機數字表法分為水迷宮組(環境對照組，模型組，DS-1226低、中、高劑量組)和避暗組(環境對照組，模型組，DS-1226低、中、高劑量組)，共10組，每組13只。

2.1.2 給藥：DS-1226低劑量18.75 mg/kg，中劑量37.5 mg/kg，高劑量75 mg/kg。分析天平稱取藥物，加蒸餾水配成混懸液，0.2 mL/10 g灌胃。環境對照組及模型組給等體積蒸餾水。造模開始前(8 am)開始給藥，每天1次。行為學檢測期間，每只動物檢測前1 h給藥。給藥持續直至行為學檢測完成。

2.2 睡眠干擾實驗

每天3 h ( 8～11 am)，連續3 d滾筒適應 ( 1 min/r，間隔5 min )后，將模型組及各給藥組動物灌胃給藥后放入滾筒(8 AM)開始干擾。滾筒以1 min/r 間隔5 min模式[9]運轉并開始計時。15 d時間到(8 am)取出水迷宮/避暗測試組與其環境對照組動物進行相應行為學檢測。檢測結束后，將干擾組動物放回滾筒繼續干擾(除行為學檢測期間取出動物外，其余時間動物均在滾筒中)。如此直至相應行為學檢測結束。

2.3 水迷宮實驗

睡眠干擾15 d時間到(8 am)后，自主活動實驗結束后進行水迷宮定位航行實驗。

小鼠Morris水迷宮計算機自動控制和圖像分析處理系統在本實驗室原有儀器[10]基礎上開發，由一個不銹鋼噴塑圓柱形水池(直徑100 cm，高38 cm)和圖像采集分析系統組成。平臺直徑6 cm，高14 cm。按東西南北將水池劃分為4 象限( NE，SE，SW，NW)，象限池壁圓弧中點為動物入水點。向池中注水并用墨汁調黑保證目標準確識別。軟件記錄動物游泳軌跡，用于指標提取和分析。

2.3.1 定位航行: Day1-6: 平臺固定于NE 象限中心，水面下1.5 cm。實驗室物品及人員位置固定作為小鼠空間參照物。每天訓練3次，每次從不同入水點( SE、SW、NW) 將動物面向池壁放入水中。檢測時間90 s，在臺上停留超過2 s視為尋臺成功，每次測試前將動物放在臺上適應10 s (前適應)，測試完畢無論尋臺是否成功均將其放在臺上適應10 s (后適應)。將動物入水到尋臺成功所需時間記作潛伏期，尋臺失敗潛伏期記90 s。用潛伏期評價動物空間學習能力。

2.3.2 空間探索:Day 7: 撤去平臺，從實臺所在象限對角象限SW入水。以90 s內穿臺次數、目標象限游程比率、目標象限時間比率評價動物空間記憶能力。

2.4 避暗實驗

睡眠干擾15 d時間到(8 am)后，自主活動實驗結束后進行避暗訓練。

小鼠避暗實驗檢測系統[11]由避暗測試箱和圖像采集分析系統組成。避暗測試箱為封閉結構，內含兩個測試箱，每個測試箱分明暗兩室(20 cm × 12 cm × 60 cm)，兩室之間均有一個小門(5 cm × 3 cm)，底部為可獨立控制通斷電的不銹鋼柵欄，應用軟件控制實驗流程并自動分析動物活動信息，提取指標。

2.4.1 避暗訓練:Day1: 將動物從明室放入自由活動5 min后取出。設置參數: 再現模式B(攝像頭識別到動物在暗室，暗室柵欄通電，動物離開，暗室斷電)、刺激電壓31V、實驗時間5 min。將動物放入暗室開始實驗，動物遭受電擊逃到明室。以5 min內錯誤次數(第1次被電不計入錯誤次數)，潛伏期(第1次從暗室到明室的時間)、暗室(錯誤區)時間、明室(安全區)時間、暗室路程評價動物避暗學習能力。

2.4.2 避暗檢測:Day 2: 避暗訓練后24 h進行。參數設置同前。將動物放入明室開始實驗，以5 min 內錯誤次數(進入暗室的次數)，潛伏期(第1次從明室到暗室的時間)、暗室時間、明室時間、暗室路程評價動物避暗記憶能力。

2.5 自主活動實驗

睡眠干擾15 d時間到(8 am)，水迷宮定位航行Day 1/避暗訓練Day 1前進行。

小鼠自主活動實時檢測分析處理系統[12]由一個封閉箱體(80 cm × 80 cm × 155 cm)、4個可移動錐桶(底直徑30 cm，上口直徑40 cm，高60 cm) 和圖像采集分析系統組成。檢測時，將小鼠沿壁放入桶內，設定參數后開始實驗。軟件自動采集分析動物10 min內運動軌跡，通過總路程、平均速度、運動總時間、靜息總時間反映動物自主活動情況。

3 統計學方法

4 實驗結果

4.1 DS-1226對睡眠干擾小鼠水迷宮成績的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組定位航行D5、D6潛伏期增加(P<0.05)；與模型組和低劑量組比較，DS-1226中劑量組D6潛伏期降低(P<0.05)；與模型組比較，DS-1226高劑量組D1-D6潛伏期降低(P<0.01)；與低劑量組比較，DS-1226高劑量組D2、D4潛伏期降低(P<0.05)，D1、D3、D5、D6潛伏期明顯降低(P<0.01)；與中劑量組比較，DS-1226高劑量組D1潛伏期降低(P<0.05)，D2-D5潛伏期明顯降低(P<0.01)。

如表2示，與對照組比較，模型組目標象限穿臺次數減少(P<0.01)、目標象限游程比率減少(P<0.05)；與模型組比較，DS-1226高劑量組目標象限穿臺次數增加(P<0.01)、目標象限游程比率和目標象限時間比率增加(P<0.05)；與低劑量組比較，DS-1226高劑量組目標象限游程比率增加(P<0.05)；與中劑量組比較，DS-1226高劑量組目標象限穿臺次數增加(P<0.05)。

表1 DS-1226對睡眠干擾小鼠定位航行潛伏期的影響(n=13)

表2 DS-1226對睡眠干擾小鼠空間探索的影響(n=13)

表3 DS-1226對睡眠干擾小鼠避暗學習的影響(n=13)

表4 DS-1226對睡眠干擾小鼠避暗鞏固的影響(n=13)

表5 DS-1226對睡眠干擾小鼠自主活動的影響(n=13)

4.2 DS-1226對睡眠干擾小鼠避暗成績的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組錯誤次數、暗室路程增加(P<0.01)，暗室時間、暗室靜息時間增加(P<0.05)；與模型組比較，DS-1226低劑量組錯誤次數減少(P<0.05)，暗室路程減少(P<0.01)，DS-1226中劑量組錯誤次數、暗室路程減少(P<0.01)，DS-1226高劑量組錯誤次數、暗室路程減少(P<0.01)，暗室時間、暗室靜息時間減少(P<0.05)，明室時間增加(P<0.05)；與低劑量組比較，DS-1226高劑量組暗室時間及暗室靜息時間減少，明室時間增加(P<0.01)。

如表4示，模型組與對照組以及各給藥組與模型組之間，錯誤次數、明室時間、暗室時間、潛伏期、暗室路程、暗室靜息時間均無統計學差異。

4.3 DS-1226對睡眠干擾小鼠自主活動的影響

如表5示，與對照組比較，模型組在以上各指標上無差異；與模型組比較，DS-1226低劑量組總路程、平均速度、運動總時間增加(P<0.05)，DS-1226中、高劑量組總路程、平均速度、運動總時間均增加(P<0.01)。

5 討論

人參是五加科植物人參Panax ginseng C. A. Mey. 的根。《神農本草經》上經(品)中記載，人參“主補五臟，安精神，定魂魄，止驚悸，除邪氣，明目，開心益智。久服，輕身延年”。因其作用廣泛神奇享有“百草之王”的美譽而備受國內外學者的重視。關于其開心益智作用的研究也成了熱門。隨著現代分離技術和分析技術的進步，人參的化學成分得到進一步闡明，人參皂苷被認為是人參的主要有效物質。有研究表明，口服人參皂苷對睡眠干擾大鼠學習記憶能力受損有明顯的保護作用[13]。另有研究表明，口服人參皂苷Rb1、腹腔注射人參皂苷Rd對東莨菪堿和環己米特所致的小鼠獲得性及鞏固性記憶障礙均具有明顯的改善作用[14]。在實驗室前期研究的基礎上，本實驗選用人參皂苷堿水解后得到的人參次苷和人參苷元混合物DS-1226，探索其對滾筒法睡眠干擾致學習記憶損害的影響。

水迷宮實驗結果表明，睡眠干擾一定時間(15 d)后會造成動物空間學習記憶能力下降。DS-1226高劑量(75 mg/kg)給藥則可以顯著改善小鼠空間學習和記憶能力，效果優于中劑量。避暗實驗結果表明，模型組小鼠避暗學習能力受損，DS-1226低、中、高三個劑量給藥均可改善造模動物避暗學習能力，且高劑量優于低、中劑量。研究發現人參皂苷Rg1、Rb1可以提高東莨菪堿癡呆動物的水迷宮空間定位學習和記憶能力[15]，人參莖葉皂甙對睡眠干擾大鼠“Y”迷宮空間分辨學習能力有明顯改善作用[16]。人參皂苷的主要促智成分Rb1和Rg1可增強膽堿能系統的功能，增加腦突觸受體對3H-膽堿的攝取，增加乙酰膽堿的合成與釋放[17]。睡眠干擾后大鼠腦干中縫核群5-HT明顯增加且隨著擾時間延長而加大，連續口服人參皂甙可使短時間干擾大鼠腦中縫核群5-HT增加，對于長時間干擾，則使5-HT累積程度減輕[18]。還有研究報道，人參皂苷對中樞5-HT的影響呈雙向性,中樞5-HT能系統對學習記憶的影響是與膽堿能系統交互作用的結果，5-HT不但作為遞質，而且作為調質發揮作用[19]。張均田等為評價人參Rg1的益智作用，建立了多種記憶障礙模型，包括老年鼠、應激鼠、缺血-再灌注、東莨菪堿及β淀粉樣蛋白等所致的認知障礙，研究證明Rg1通過多種途徑和機制增加神經可塑性，如提高突觸效能和結構可塑性、中樞乙酰膽堿含量和M-膽堿受體密度增加和FOS蛋白、BDNF表達增加[20-22]。DS-1226改善睡眠干擾動物空間定位學習記憶能力及避暗學習能力可能與以上機制有關，有待進一步研究。至于避暗鞏固結果顯示模型組避暗記憶能力未受損害，各給藥組與模型組之間避暗記憶也無差別，可能與電擊這種恐怖記憶一旦獲得就很難忘記有關[23]。

從自主活動結果來看，睡眠干擾15d對ICR小鼠自主活動影響較小。這也與前期研究結果一致，可能是因為動物對滾筒滾動已經產生了適應，同時也再次驗證了滾筒法睡眠干擾結果的穩定性和可靠性[9]。人參對中樞神經系統的鎮靜和興奮雙向調節作用與用藥時神經系統的功能狀態、用藥劑量及人參不同成分有關[24]。DS-1226給藥各劑量組動物自主活動均顯示總體活動增加，這可能與以上三種因素相關，還需進一步研究。

綜上所述，DS-1226口服給藥可以改善滾筒法睡眠干擾15 d導致的小鼠空間定位學習、記憶能力及避暗學習能力障礙，且高劑量(75 mg/kg)效果最為明顯，可為益智中藥的研究提供參考。

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