乙酸聯(lián)合束縛應激對大鼠內臟敏感性及腸道肥大細胞狀態(tài)的影響

莊肇朦，王霄騰， 呂 賓

(浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院消化科，杭州 310000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一種以腸道局部癥狀為突出表現(xiàn)的全身性疾病，其發(fā)病率正在逐年上升[1]。前期實驗研究表明：IBS患者及模型大鼠腸道均存在肥大細胞數(shù)量增多，細胞脫顆粒增強的現(xiàn)象。近年來有研究發(fā)現(xiàn)[2]：大鼠乙酸灌腸后第7 天腸黏膜組織學和髓過氧化物酶活性恢復正常, 但大鼠對直腸擴張刺激的敏感性持續(xù)增高。 同時早有相關研究發(fā)現(xiàn)[3]：慢性束縛應激可以引起大鼠排便的明顯增多, 內臟敏感性增高。這些表現(xiàn)均與IBS的特征吻合。目前建立IBS動物模型的刺激方法主要有三種類型:軀體應激、心理應激和綜合應激。軀體應激的方法包括醋酸刺激法、冰水灌胃法等；心理應激的方法包括束縛應激法、母嬰分離法等。鑒于IBS病因、病機的復雜性及多重性，建立多成分綜合性動物模型更符合IBS的實際情況[4]。因而本實驗分別模擬心理因素和軀體因素兩種病因,以乙酸聯(lián)合束縛應激這種方法，通過與單純的束縛應激比較，試圖建立綜合因素所致的IBS模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

成年雄性SD大鼠30只，體質量(200±5)g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司生產，許可證號：SCXK(滬)2013-0016；實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)2013-0184。

1.2 儀器與試劑

8F導尿管(直徑2 mm, 球囊最大容量3 mL， 最大直徑2 cm)，用作結直腸內球囊擴張導管(浙江康康醫(yī)療器械有限公司生產)；冰乙酸。

1.3 動物實驗

1.3.1 分組： 整個實驗操作過程均飼養(yǎng)于標準的Ⅱ級動物房。適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為3組：IBS組：模型組1：乙酸灌腸+束縛應激組，模型組2：束縛應激+生理鹽水灌腸組；正常對照組。

1.3.2 大鼠模型制備： IBS組：實驗前24 h禁食不禁水，乙醚麻醉后經肛門插入連接注射器的硅膠管(距肛門8 cm)，結腸內灌入40 mL/L的乙酸1 mL, 緩慢拔出硅膠管, 用手壓迫肛門并將大鼠尾巴抬高30 s，后用0.01 mol/L PBS 1 mL沖洗結腸，放回籠中自由活動進食水[2]；模型組2則用生理鹽水代替乙酸進行灌腸處理。于第7天行束縛應激，按照Williams方法略作修改[5]將大鼠置于一限制起肢體但不影響其呼吸的特制透明圓柱形筒內， 3 h后將大鼠放入飼養(yǎng)籠中，連續(xù)束縛3 d。正常對照組：不做處理。

1.3.3 大鼠糞便顆粒及形態(tài)實驗：實驗第7天，將每只大鼠分別放在大鼠固定器內，限制其活動(不限制呼吸)約2 h，期間大鼠的糞便分為硬便、軟便、不成形便，分別計數(shù)。

1.3.4 大鼠結直腸擴張：實驗第 10天禁食24 h，禁水12 h。兩組大鼠分別于清醒狀態(tài)下放入自制的固定器，使大鼠只能上下運動，無法前后活動及轉身，將 8F 導尿管經肛門緩慢插入，氣囊末端距肛門約2 cm并固定。30 min后大鼠適應，經外口氣囊內先后注入氣體，按腹壁撤回反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)試驗標準評分，分別記錄評分達到傷害閾值2分時(大鼠腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面)和4分(大鼠腹部肌肉強烈收縮，背部呈弓形并把腹部、會陰部抬離地面)時球囊所注入的氣體量，每4 min一次，每次約30 s，每只重復3次，取平均值。

1.3.5 結腸標本的采集及HE 染色、回盲部腸道標本鹽酸甲苯胺藍染色:實驗第2天，隨機取各組大鼠各3只，3%巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后取大鼠結腸(距肛門約 6 cm)1 cm 腸段。實驗第10天，取所有大鼠結腸(距肛門約 6 cm)1 cm腸段，行HE染色；取回盲部腸段1 cm，鹽酸甲苯胺藍染色。

1.3.6 統(tǒng)計方法及分析:以SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各組間 AWR 評分比較，排便計數(shù)的比較以及腸道粘膜肥大細胞數(shù)量比較均采用t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 糞便結果

如表1 所示結果分析：于造模第7天行束縛應激刺激后，可見模型組大鼠在排便數(shù)量上大于對照組，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且模型組1軟便及稀便數(shù)量明顯較模型組2和對照組增多。此項結果顯示，模型組在乙酸灌腸聯(lián)合束縛應激后排便次數(shù)明顯增多，排便性狀改變，符合 IBS 特征。

2.2 結直腸球囊擴張(colorectal distension, CRD) 結果——腹部回撤反應

腹壁撤回反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)評分結果如表2所示：第10天時，直腸擴張達到傷害感受閾值AWR=2分時，模型組1直腸擴張容量平均為1.2 mL，模型組2平均為1.37 mL，而對照組平均為1.49 mL，兩兩之間有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；當直腸擴張達到AWR=4分時，模型組1直腸擴張容量平均為1.49 mL，模型組2平均為1,74Ml，而對照組平均為1.77 mL，模型組1與后兩者之間有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明模型組大鼠內臟敏感性較對照組增高。

2.3 結腸外觀變化及 HE 結果

乙酸灌腸后第1天，肉眼觀察，模型組大鼠結腸外觀管壁增厚，伴充血及出血，光學顯微鏡下觀察，與對照組(圖3 A)相比，模型組乙酸刺激后(圖 3B)可見粘膜層、粘膜下層水腫明顯，出現(xiàn)片狀出血點。

而待到實驗第10天，完成CRD測評后，取材后肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，兩組腸粘膜外觀無充血、水腫、出血；光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組(圖 3C)、模型組1(圖 3 C)兩組大鼠結腸粘膜結構均較為完整，隱窩、上皮及各層組織均較為完整，未見潰瘍等組織病理學改變，因此可排除炎癥性腸病等疾病可能(圖3見封三)。

2.4 甲苯胺藍染色結果

光學顯微鏡下示肥大細胞(MC)細胞質呈紫紅色，胞核呈藍色，散在于粘膜下層和粘膜固有層中。電鏡下可見其中未脫顆粒者胞膜完整，胞質均勻(圖 4C)，脫顆粒者胞膜破裂，有顆粒涌出，細胞不規(guī)則(圖 4 D、4E、4F)。經SPSS軟件統(tǒng)計后(表3)模型組1大鼠結腸 MC數(shù)目較模型組2及對照組明顯增多(P<0.05)。(圖4見封三)。

表1 兩組大鼠排便情況差異

表2 當AWR=4分時兩組結直腸球囊擴張容量差異(單位mL)

表3 兩組大鼠結腸MC數(shù)目比較差異

3 討論

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是世界范圍內的多發(fā)病。其中歐美國家人發(fā)病率達10%～20%[6]，亞洲國家的發(fā)病率達6.5%～10.1%，且近年發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[1]。由于其病因和發(fā)病機制不明確，臨床上缺乏有效的診治手段，導致IBS患者的癥狀長期存在，嚴重影響其工作和生活，因此，IBS不僅是一個臨床問題，更是值得關注的社會問題。因而對IBS病因及發(fā)病機制的研究日漸得到各方研究者的關注，而其中關于IBS動物模型的建立，由于IBS病因及發(fā)病機制的復雜性，患者癥狀的多樣化，導致動物模型研制的困難。因而，作為進行深入研究的對象和基礎，IBS動物模型的建立方法以及模型有效性的評估仍是諸多研究者所關注的。

近年來已出現(xiàn)了可模擬IBS某些病理生理學特征的動物模型，并獲得部分成功。目前較多的都是根據體外單因素建立的符合IBS某一方面的病理生理機制的動物模型，如通過刺激腸道建立的內臟痛覺過敏模型，通過化學物質刺激或病原體感染腸道造成的內臟痛模型，通過應激刺激造成的動物胃腸動力紊亂等，以及涉及轉基因或基因沉默、基因敲除而制得的動物模型。

現(xiàn)有的IBS動物模型主要分為兩大類，一類是以中樞為靶點的刺激;二是以外周為靶點的刺激造成的IBs動物模型[7]。

以中樞為靶點刺激造成的IBS動物模型:主要模擬了精神心理因素在IBS中的作用。流行病學相關研究發(fā)現(xiàn)[8]，急慢性應激是誘發(fā)和加重IBS患者癥狀的重要因素之一,其作用機制是應激可以通過促進促腎上腺皮質激素釋放因子CRF釋放，以及肥大細胞的聚集活化等進而導致胃腸功能紊亂[9]。多項研究表明：束縛應激可導致大鼠對直腸球囊擴張的敏感性增加，應激后大鼠排便量增加，其所導致的胃腸道動力及內臟感覺的改變與IBS的特征相符[10-11]。雖然這類動物模型模擬了人類的IBS的重要病因之一即精神心理因素，與人類IBS有一定的相似性[12]，但臨床上精神創(chuàng)傷并不是導致IBS的單一以及直接原因，只是誘發(fā)或加重IBS癥狀的重要因素之一，因而僅可將其作為IBS動物模造模的單一因素。

以外周為靶點刺激造成的IBS動物模型: 其特征是黏膜炎癥反應消失后異常的腸道感覺及運動功能仍持續(xù)存在。研究較多的是病原體感染和化學刺激物誘導制成的IBS動物模型[13]。其中病原體感染所致模型與臨床上感染后IBS較為符合，急性胃腸炎患者在早期癥狀緩解后出現(xiàn)類似IBS 的腸功能紊亂癥狀，現(xiàn)有研究表明早期胃腸道感染持續(xù)時間和嚴重程度、致病微生物因素、精神因素、基因多態(tài)性等均會影響 PI-IBS 的發(fā)病[14]，然而大多數(shù)PI-IBS的臨床病例為細菌、病毒等感染而非僅僅由寄生蟲感染后誘發(fā)，故而此模型與PI-IBS的病因學特征不完全相符。化學刺激所造成的IBS模型則可直觀地模擬臨床上因食物刺激以及病原體急性感染后所致的急性腸黏膜炎癥反應。新近研究發(fā)現(xiàn)[1]：大鼠乙酸灌腸后第7 d腸黏膜組織學和髓過氧化物酶活性恢復正常, 但大鼠對直腸擴張刺激的敏感性持續(xù)增高。

Arebi等[15]發(fā)現(xiàn)IBS發(fā)病為多種因素相互作用所致。鑒于IBS病因的復雜性、病機的多重性，因此，建立多成分綜合性動物模型更符合IBS的實際情況。

相關研究已證實肥大細胞(MC)與IBS發(fā)病直接相關[16-17]，結腸MC浸潤和介質釋放是IBS患者產生癥狀的原因，亦與IBS患者內臟高敏感密切相關[18]。MC活化后釋放組胺、5-羥色胺、纖維蛋白溶酶等介質，激活包括胃腸道在內的感覺神經元，導致痛覺增敏或異常疼痛。因而腸道粘膜肥大細胞數(shù)量的增多、活化脫顆粒是IBS的特征之一。

本實驗通過乙酸聯(lián)合慢性束縛應激對SD大鼠進行造模刺激，與單純的束縛應激進行比較，通過觀察糞便情況、內臟敏感性的觀察，來評估此綜合造模方法的有效性；并且通過對肥大細胞的數(shù)量及脫顆粒情況的觀察，發(fā)現(xiàn)該綜合造模方法可對IBS模型動物腸道免疫應答起到激活作用。

4 結論

乙酸聯(lián)合束縛應激可增加大鼠內臟敏感性，并且使大鼠腸道肥大細胞數(shù)量增多，細胞脫顆粒現(xiàn)象增強。該綜合造模方法能夠較好的模擬人類IBS的發(fā)病形式，為我們進一步研究IBS的發(fā)生發(fā)展機制提供了理想的動物模型基礎。

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