非人靈長類動物體外受精-胚胎移植(IVF-ET)手術室建設及使用探討

江勤芳，高家紅，曾 橋，唐東紅，和占龍，馬開利

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所藥物安全性評價研究中心，昆明 650118；2.同濟大學轉化醫學中心，上海 200039)

非人靈長類動物在生物進化、生殖生理等方面與人類極為相似，擁有與人類相似的單子宮，盤狀血絨毛型胎盤，尤其是雌性恒河猴，它們具有與人相似的月經周期，是研究人類生育調控機制、體外受精及胚胎移植的理想動物[ 1-2]。非人靈長類動物(包括恒河猴、食蟹猴等其它非人靈長類動物)體外受精及胚胎移植研究的開展將為人類生殖及轉基因動物模型的建立提供更為廣闊的應用前景。而合理化及標準化手術室的建設，是確保研究順利開展的前提條件。非人靈長類動物體外受精-胚胎移植手術室既具有“實驗動物設施”的特點，又具有人類醫療手術室的某些特征；既要滿足人員在潔凈室內操作的要求，又要滿足實驗動物的需要[ 3]。因此我們綜合考慮了人員、動物以非人靈長類動物體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)研究的需要，并結合本中心實際情況建立了手術室。目前已經順利開展了15只實驗猴的取卵及胚胎移植工作，現將相關工作進行總結及探討。以下將從硬件建設、軟件建設及使用幾個方面分別進行探討。

1 硬件

(IVF-ET)實驗人員必須依賴和利用相應的儀器設備，才能進行各種精細的操作，并為卵子受精和胚胎發育提供一個穩定、可靠的環境。

1.1 房間布局

手術室設置在配有空調凈化系統的屏障系統內，通過空調系統對空氣進行初效、中效和高效三級過濾，嚴格控制進入室內空氣中的微粒數量，確保整個手術室空氣質量及房間內溫度達到相應要求。屏障系統需通過相關管理機構的認證，取得《實驗動物設施使用許可證》后方可開展非人靈長類動物的實驗研究。實驗人員通過更衣室(一更、二更)、使用自動凈手器洗手消毒后進入屏障環境內，同時還要對進入室內的器具、實驗耗材等進行消毒滅菌。

1.2 全數字超聲診斷系統

非人靈長類動物體外受精-胚胎移植手術室可選用獸用超聲診斷儀。B超儀是必不可缺的有效工具，在此實驗中貫穿整個過程。非人靈長類動物尚未注射促排卵藥物之前，首先需要用B超確認動物是否處于非受孕狀態，確認處于非懷孕期的動物即可觀察子宮情況，包括子宮大小及子宮內膜周期性變化。在使用促排卵藥物之后，可用B超觀察卵泡的生長發育情況[ 4]，卵泡成熟后可在B超下看到清晰的網狀結構，從而能夠根據B超的結果分析和評估藥物促排卵效果，最終確定動物取卵的時間點。在施行外科手術之前，為便于對卵巢的手術操作，需要B超仔細觀察動物腹腔內狀況。胚胎移植后，需用B超觀察動物是否受孕。因此，B超診斷系統應配置不同分辨率的腹部凸陣探頭、線陣探頭，同時具有前沿的成像技術、完善的數據管理才能確保實驗的順利進行。

1.3 電刺激采精儀全套

電刺激采精是非人靈長類人工受精、體外受精和精子生物學研究過程中獲得精子的基本手段。在有關非人靈長類電刺激采精的報道中，陰莖和直腸電刺激采精是較常用的方法[5]。動物電刺激采精儀是利用低電壓小電流交流電刺激動物輸精管壺腹部附近的感覺神經末梢,然后傳導到射精中樞,產生興奮而排精的人工采精方法。本中心在開展實驗前購置了電刺激采精儀，選用直腸刺激的方法進行精液的采集。電刺激采精儀應配備與非人靈長類動物適合的刺激電擊棒，電擊棒粗細的直徑約為1.5 cm，長度為30 cm左右即可。具有電壓、電流的選擇按鈕，刺激過程中可方便電流或電壓調諧。同時具備電源手動和自動切換開關，便于實驗人員控制連續刺激或間隙刺激時間。刺激電擊棒在使用時，在前端要涂抹少量凡士林，以潤滑電極棒。實驗中可根據不同的個體及動物臨床表現選擇電流的大小或刺激時間的長短。

1.4 顯微操作注射系統

包括倒置顯微鏡、精確定位的顯微注射操作器及成像系統(圖1)。倒置顯微鏡應具備霍夫曼調制相差(Hoffman Modulationcontrast)及微分干涉相差(differential interference phase contrast microscope，DIC)功能，以便能夠形成高對比度的圖像，從而可以較好地使用塑料培養皿來觀察卵細胞，便于顯微操作。顯微鏡及顯微操作需通過同一系統進行控制，從而實現將單一精子注射入卵子內使其受精的操作過程。顯微操作注射系統應具有較高分辨率、對比度以及人性化的操作系統，以便有效提高單精子卵胞漿顯微注射的成功率。

圖1 顯微操作注射系統

1.5 其它必需設備

(1)顯微鏡及顯微恒溫熱臺。選用工作距離大、聚焦深度大的解剖顯微鏡，其物鏡放大倍數為×0.7～×11.5，目鏡×10，可方便選卵、觀察胚胎。體外胚胎對溫度的變化非常敏感，顯微恒溫熱臺是必備的輔助設備，其溫控性能需穩定可靠，使溫度能長時間穩定在所需要的數值上。(2)三氣培養箱。實驗中研究對象均來自于非人靈長類動物機體，細胞的體外培養要求非常嚴格，不僅要有適合的溫度、濕度，且要有潔凈的氣流循環。三氣培養箱是指可供有氮氣、二氧化碳和氧氣三種氣體的培養箱，三種氣體的比例通常是氮氣90%、二氧化碳5%、氧氣5%。可為胚胎提供相對穩定的體外生長環境，如恒定的酸堿度(pH:7.2～7.4)、穩定的溫度(37℃)、較高的相對濕度(95%)、穩定的CO2水平，使胚胎完成體外發育，配子離體后幾乎所有的時間都在培養箱內完成其體外發育，因此培養箱的精確性非常重要[7]。培養箱箱內采用微風循環方式，使空氣循環接近自然界空氣對流，縮短溫度、濕度、O2濃度和CO2濃度的恢復時間，確保溫度、濕度、O2濃度和CO2濃度的均衡性。其應具有清晰的操作控制界面，該界面一方面顯示箱體內的實時溫度、濕度、氣體濃度，又要方便操作者進行數值的設定或校正。其次，應具備數值異常報警裝置，便于對其環境的監控。(3)超凈工作臺。超凈工作臺是應用于手術室的局部凈化單元，目的是保證工作區內的風速始終處于理想狀態，其環境條件滿足所需培養基、試劑的配制要求，同時方便開展實驗用具制作等方面的工作，例如移卵玻璃毛細管拉制等。

1.6 (IVF-ET)外科手術所需配置

(1)動物手術床。動物手術床應便于操作，具有溫度控制器，滿足動物麻醉后在手術過程中的保溫需求。同時，手術床應具有調節升降的功能，增加動物在手術中的舒適度并便于實驗人員操作。在手術中通常將溫度調節到30℃左右[6]。當動物處于深麻醉狀態需使用較高的臺面溫度時，在手術過程中需適時輕輕移動動物，以免動物局部不適。(2)無影燈。在對動物進行手術過程中，無影燈可以有效照射手術部位，避開血管并便于對卵巢及輸卵管的觀察，在手術中應方便使用，操作簡單，可通過移動進行光源遠近式調節，以及通過旋鈕對燈頭高度和角度進行調節。(3)心電監護儀。為提高對手術中非人靈長類動物的關懷，采用心電監護儀監護主要的生命指標:心率、心電圖、呼吸、脈搏等。在手術過程中，可根據手術時間長短及動物麻醉狀況決定是否啟用心電監護儀。(4)手術器械全套。在實驗開始前，購置適合非人靈長類動物的全套手術器械。包括組織鉗、止血鉗、卵圓鉗、手術剪、手術刀、拉鉤、縫合針及縫合線，準備無菌紗布及棉花等器械及耗材，在實驗前一天打包進行高壓滅菌處理、烤干后備用。

2 軟件

非人靈長類動物體外受精-胚胎移植(IVF-ET)手術室的建設，硬件和軟件缺一不可。

2.1 創建一個團結和良好合作的團隊

由于非人靈長類動物(IVF-ET)還在起步探索階段，可與有豐富經驗的人類輔助生殖中心聯合開展實驗，以便在關鍵實驗技術方面得到積極和有效的指導。

2.2 具有熟練掌握顯微注射、卵細胞培養、精子冷凍及復蘇、胚胎培養等胚胎移植相關實驗技術的人員。

2.3 配備熟練掌握操作B超儀的技術人員，以便能對B超圖像進行熟練采集并作出科學正確的判斷，并能在B超圖像的引導下，快速及準確對動物進行外科手術。

2.4 對動物精心護理的飼養人員及獸醫師

在實驗中能及時發現非人靈長類動物的月經及其它異常情況，給予準確合理的處理方案。同時規范麻醉藥的用量及完成動物手術中生命體征的監護，確保動物在手術前及手術后能得到精心和細致的護理。

3 手術室的使用

目前，本中心手術室已開展15例非人靈長類動物的IVF-ET研究。B超過程中，選用分辨率為6.5 MHz的探頭可清楚觀察到卵巢，但因人類的陰道探頭外形直徑較大而不適用于非人靈長類動物陰道探測，因此首先選用此探頭直接在腹部觀察實驗猴經促排卵藥物處理后卵泡的生長發育情況(圖2)，然后再通過腹部手術切口，暴露卵巢后用注射器直接抽取卵泡的的方式獲取卵子。今后在開展實驗的過程中可與B超機生產廠家聯系，爭取開發或選購到直徑大小適宜非人靈長類動物陰道探測的探頭，從而對超聲引導下經陰道穿刺取卵術進行積極的探索和嘗試。超聲引導下經陰道穿刺取卵具有簡便、快捷，痛苦小、創傷小，不用全身麻醉和并發癥少等優點[8]，在今后非人靈長類動物的IVF-ET中，有必要對陰道穿刺取卵術開展一些有效的探索。

圖2 促排卵后，月經周期第12天卵巢B超圖

在本中心開展的實驗研究中，由于對三氣培養箱密集使用，氮氣消耗比較快，而頻繁的更換氮氣瓶，也對手術室環境帶來了潛在的污染風險。在今后改進及完善過程中，可使用氮氣發生器，從而減少更換氮氣瓶對環境的潛在污染。研究實驗中為下一步轉基因動物的開發進行探索，沒有采用精子和卵混合培養方式完成體外受精，而是借助單精子卵母細胞內注射受精技術(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)實現精卵結合完成受精過程。ICSI受精的胚胎有與自然受精形成的胚胎相似的發育潛力，其具有受精率高、精子濃度形態對受精無影響的特點[7]，對開展的實驗研究起到積極的促進作用。缺點是設備精密而昂貴、操作技術需要長時間反復的練習，在練習過程難免會發生把針弄斷的情況。在有條件的手術室，可配置拉針器、磨針器和鍛針器，更好便于初學者對顯微操作技術的練習。

4 討論

非人靈長類動物(IVF-ET)手術室的建立，將使非人靈長類動物在生殖醫學領域的研究向更深層次拓展，并將更充分發揮其在研究人類生殖疾病方面的作用。建立非人靈長類動物體外受精-胚胎移植手術室是一個系統工程。除上述以外，一些實驗儀器也是必需的，例如用于存放需冷凍及冷藏試劑的冰箱；用于胚胎冷凍保存的液氮罐；電子天平、純水儀等。手術室建立后，需建立可行的手術室管理規章制度及操作規程；在手術前、后需對環境進行合理有效消毒，使環境及實驗體系處于有效地質量控制之下，才能確保手術室得到規范化使用。同時，實驗人員應珍惜和善待動物，采取動物福利的相關措施，給予動物人性化關懷。本中心的手術室工作距離短，便于實驗人員操作，可進行快速取卵和取精。但由于手術室是在土建施工完成后因地制宜而建立，所以也存在不完善的地方。例如手術室面積不夠大，實驗設備配置多。為保障多人在手術室內的有序操作，需要建立相應的規章制度及操作規程并嚴格執行。與人類的輔助生殖相比，非人靈長類動物的(IVF-ET)尚在探索和起步階段，不論從硬件和軟件上，還有一定差距，今后在擴建非人靈長類動物手術室過程中可嘗試參照人類的改進和進一步完善。

參考文獻：

[1] Wolf D，Mitalipov S，Byrne J. Primate Models for the Assisted Reproductive Technologies and Embryonic Stem Cell Biology[J].Sourcebook of Models for Biomedical Research，2008，V ( B) :397.

[2] Davison BB, Cogeswell FB, Baskin GB,etal. Plasmodium coatneyi in the rhesus monkey(Macacamulatta) as a model of malariain pregnancy[J]. Am J Trop Med Hyg，1998，59(2):189-201.

[3] 徐桓，唐強根. 長海醫院動物手術室設計及施工的經驗體會[J]. 實驗動物科學與管理，2000，17(2)：45-49.

[4] Morgan PM，HutzRJ，Kraus EM，etal. Evalution of ultrasonography for mornitoringfollcular growth in rhesus monkey [J]. Theriogenology,1987，27:769-780.

[5] 楊上川， 季維智， 陳建春，等. 一種改進的陰莖電刺激采精法和獼猴藏酋猴及熊猴的采精及其精液特征的初步研究[J]. 動物學研究，1994，15 (1) : 77-83.

[6] 蔡文訓，董振明，康榮田，等. 低溫對麻醉犬血液動力學及流變學的影響[J]. 中華麻醉學雜志,2000,20:286-289.

[7] 黃國寧，孫海翔，主編. 體外受精-胚胎移植實驗室技術[M]. 人民衛生出版社，2012，9：175.

[8] 李美芝，主編. 婦科內分泌學[M]. 人民軍醫出版社，2001：375.