鏈脲佐菌素糖尿病腎病大鼠模型的建立及穩(wěn)定性評價(jià)

張麗芬，呂仁和，黃文政

(1．北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科， 北京 100029； 2．北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院腎病科， 北京 100700；3．天津中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院腎病科，天津 300193)

目前用于糖尿病腎病研究的模型眾多，但理想的模型仍然缺乏。模型的標(biāo)準(zhǔn)不十分統(tǒng)一，模型的優(yōu)劣仍然存在。在眾多的模型中，鼠類糖尿病腎病動物模型具有容易操作、建模成功率較高等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用[1-2]。鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病腎病模型目前應(yīng)用較多，成模標(biāo)準(zhǔn)相對統(tǒng)一，但缺少對該模型系統(tǒng)動態(tài)觀察和穩(wěn)定性評價(jià)。本研究的目的是全面觀察STZ誘導(dǎo)的大鼠糖尿病腎病模型，動態(tài)監(jiān)測一般狀況、生化、病理等與臨床的符合程度。以期對STZ誘導(dǎo)的DN模型有更全面深入的認(rèn)識，為臨床藥效學(xué)評價(jià)和臨床基礎(chǔ)研究提供載體。

1 材料和方法

1.1 動物

健康SD大鼠66只，SPF/VAF清潔級，雄性，體重(180～220)g，來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物公司[SCXK(京)2006-0009]。飼養(yǎng)和無菌手術(shù)在中國中醫(yī)科學(xué)院基礎(chǔ)理論所二級動物室進(jìn)行[SYXK(京)2010-0032]。并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 試劑

鏈脲佐菌素(Sigma公司，批號：B69776)。PAS染色試劑盒(periodic acid-Schiff reaction kit)由北京天合力恩科技發(fā)展中心提供。

1.3 儀器

Olympus AU640全自動生化測試儀(日本Olympus公司產(chǎn)品)。BN Prospec型全自動蛋白檢測儀及試劑(德國Dade Behring公司)。病理切片機(jī)(Leica RM 2135 德國)、病理包埋機(jī)(Leica EG1160 德國)、烤片機(jī)、病理切片架、立式染缸、孵育盒、定時(shí)器、沖洗瓶、Leica HI1220水浴鍋、圖像攝取系統(tǒng)(Leica DM 4000B-DFC 300 FX)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作：大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取10只作為假手術(shù)對照組，余56只大鼠行左腎摘除術(shù)，術(shù)后1周尾靜脈注射STZ 35 mg/kg(用0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH=4.2，4℃，配制成2% STZ溶液)，72 h后，測空腹血糖(FPG)及尿糖，以FPG≥16.65 mmol/L、尿糖強(qiáng)陽性、尿量大于假手術(shù)組的50%者為模型制備成功,隨機(jī)選取造模成功大鼠45只入選實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組(F組)大鼠在腹腔麻醉狀態(tài)下，打開腹腔，剝離左腎脂肪包膜，關(guān)閉腹腔，縫合切口，術(shù)后1周尾靜脈注射等體積的緩沖液。實(shí)驗(yàn)期間每組大鼠分籠飼養(yǎng)，隨意飲水，食用標(biāo)準(zhǔn)動物飼料。

1.4.2 標(biāo)本采集及檢測：模型大鼠實(shí)驗(yàn)4、8、12、16周末稱體重，計(jì)飲水量；隨機(jī)取8只大鼠，代謝籠收集尿液，送檢尿微量白蛋白；并收集24 h尿液，混勻，測其總量，取出(1～3) mL，采用比色法測定24 h尿蛋白含量。大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)5%戊巴比妥鈉麻醉后，心臟取血，采用Olympus AU640全自動生化儀測定實(shí)驗(yàn)大鼠空腹血糖(FBG)，糖化血紅蛋白(HbA1c)、血脂、血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)。

2 結(jié)果

在注射STZ 3 d后，造模成功率88.6%。實(shí)驗(yàn)過程中，假手術(shù)組大鼠體重增加明顯，狀態(tài)良好。模型組共有3只成模大鼠死亡，大鼠可見多食、多飲、多尿、消瘦明顯，反應(yīng)遲緩，毛無光澤，豎毛蜷臥。部分成模大鼠出現(xiàn)白內(nèi)障。

2.1 糖尿病腎病大鼠血糖、飲水量、尿量和體重的變化

假手術(shù)組大鼠整個(gè)研究過程血糖穩(wěn)定在(6～8) mmol/L，糖尿病腎病模型組大鼠在造模后3 d、4、8、12、16周血糖持續(xù)升高，在(24～31) mmol/L之間，與假手術(shù)組比較差異有非常顯著性(P< 0.01)。

單側(cè)腎切除后1周各組大鼠體重沒有差異性，STZ注射后3 d成模大鼠體重下降，成模后0～12周體重增長緩慢，12周～16周體重負(fù)增長趨勢，各個(gè)時(shí)段兩組差異均有非常顯著性(與假手術(shù)組比較P均<0.01)。

模型組大鼠隨成模時(shí)間延長飲水逐漸增多，0、4、8、12、16周時(shí)均數(shù)比較分別是假手術(shù)組的2.35倍、5.55倍、8.84倍、9.01倍、10.40倍(與假手術(shù)組比較P均<0.01)。

假手術(shù)組大鼠尿量穩(wěn)定在13 mL左右，模型組大鼠4周末尿量為假手術(shù)組的22倍，8周末達(dá)到最高，均值為220 mL，約為假手術(shù)組16倍左右，12、16周末分別為假手術(shù)組9.98倍和5.33倍(與假手術(shù)組比較P均<0.01)。見表1和表2。

2.2 糖尿病腎病大鼠糖化血紅蛋白、尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量的變化

糖尿病腎病大鼠糖化血紅蛋白4、8、12、16周末持續(xù)升高，與假手術(shù)組比較均有顯著性差異(P<0.01)，糖尿病腎病組尿微量白蛋白、24 h尿蛋白在4周末顯著升高，與假手術(shù)組比較差異有顯著性或非常顯著性(P<0.01或P<0.05)，8、12周末尿微量白蛋白和24 h尿蛋白進(jìn)一步增加，16周末稍有下降趨勢，與假手術(shù)組比較差異均有非常顯著性(P<0.01)。提示4周時(shí)已呈現(xiàn)糖尿病腎病早期表現(xiàn)，8、12、16周糖尿病腎病逐漸加重。見表2。

2.3 糖尿病腎病大鼠血脂的變化

糖尿病腎病大鼠甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白-膽固醇在4周末即有顯著升高，4、8、12、16、20周末持續(xù)在顯著升高的狀態(tài)，與假手術(shù)組比較差異均有顯著性或非常顯著性(P<0.01或P<0.05)；提示糖尿病腎病大鼠存在輕度血脂代謝異常(表3)。

2.4 糖尿病腎病大鼠血尿素氮和血肌酐的變化

糖尿病腎病大鼠4、8、12、16周末血尿素氮顯著增加，與假手術(shù)組比較差異有非常顯著性(P<0.01)；血肌酐在4周時(shí)與假手術(shù)組比較顯著升高，差異有非常顯著性(P<0.01)，在8、12、16周末比假手術(shù)組稍有增加，但差異無顯著性(P>0.05)(表4)。

2.5 糖尿病腎病大鼠腎小球硬化指數(shù)和細(xì)胞外基質(zhì)的變化

假手術(shù)組大鼠腎小球毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完全沒有破壞，糖尿病腎病組大鼠病理改變腎小球硬化指數(shù)和細(xì)胞基質(zhì)面積隨造模時(shí)間延長而逐漸增加(表5)。

表1 糖尿病腎病大鼠空腹血糖、體重、飲水量和尿量的比較

表2 糖尿病腎病大鼠糖化血紅蛋白、尿微量白蛋白和24 h尿蛋白定量的的比較

表3 糖尿病腎病大鼠血脂的變化

表4 糖尿病腎病大鼠尿素氮和血肌酐的變化

表5 糖尿病腎病腎小球硬化指數(shù)和細(xì)胞外基質(zhì)面積比的變化

3 討論

近年來，糖尿病的發(fā)病率逐漸上升，2010年發(fā)表的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國20歲以上人群糖尿病患者率已達(dá)9.7%[3]，糖尿病腎病作為糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，2010年美國新增透析患者中糖尿病腎病超過了50%[4]，我國終末期腎病中糖尿病腎病患者僅次于腎小球腎炎。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和防治措施研究非常迫切，因此，穩(wěn)定且能夠模擬人類糖尿病腎病的動物模型對本病的研究具有不可替代的作用。目前研究糖尿病腎病的動物模型主要有自發(fā)性、基因工程型和誘發(fā)性3種，每種動物模型中含有10余種不同的造模方法[5-7]。我們參閱了大量文獻(xiàn)，考慮到既要確保糖尿病腎病動物模型與人類糖尿病腎病病程的相符，又要實(shí)用經(jīng)濟(jì)和有很好的可行性，我們選用了誘發(fā)性糖尿病腎病動物模型中的大鼠單側(cè)腎切除加上尾靜脈注射鏈脲佐菌素的方法[8]。這是一種改良后的模型方法，可縮短實(shí)驗(yàn)周期，減少化學(xué)藥物的劑量，但其模型欠穩(wěn)定。本研究吸取以往動物模型的經(jīng)驗(yàn)[9]，保證了手術(shù)的成功率和藥物的準(zhǔn)確性。在手術(shù)中選用背部開口1 cm～1.5 cm，避免經(jīng)腹腔造成腹腔感染和腸梗阻；選擇切除左腎，保留右腎，是因?yàn)樽竽I下無重要臟器，且左腎系膜較長，位置較右腎低，有利于固定和切除。鏈脲佐菌素的注射有腹腔注射和尾靜脈注射，我們采用了尾靜脈注射，以確保藥物劑量的準(zhǔn)確無誤及吸收充分。

臨床糖尿病腎病主要表現(xiàn)為持續(xù)的血糖、糖化血紅蛋白的升高和血脂異常，大量蛋白尿；并有飲水量多、尿量多和消瘦的癥狀。尿微量白蛋白、糖化血紅蛋白、血脂等聯(lián)合檢測對糖尿病動物模型的早期監(jiān)控、診斷、治療及預(yù)后有重要意義[10]。我們的研究結(jié)果顯示：在注射STZ 后3 d，造模成功率88.6%，成模大鼠飲水量、尿量即有顯著增多，血糖顯著升高。之后4周末成模大鼠的飲水量、尿量進(jìn)一步增多，血糖、糖化血紅蛋白持續(xù)升高，尿中微量白蛋白和24h尿蛋白定量明顯增加，血脂升高，尿素氮、肌酐升高，體重增長緩慢。病理表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎小球硬化指數(shù)增加，腎臟損傷的臨床指標(biāo)和病理變化均提示糖尿病腎病造模成功。8、12、16周時(shí)，糖尿病腎病大鼠腎臟病變逐漸進(jìn)展，除血肌酐外各項(xiàng)臨床指標(biāo)與假手術(shù)組比較均有明顯增多或升高，尤其尿蛋白的增長約為假手術(shù)的10倍左右，符合糖尿病腎病大量蛋白尿的臨床特點(diǎn)。體重與假手術(shù)組比較有明顯降低，糖尿病腎病大鼠體重增長緩慢，16周體重顯示呈負(fù)增長，表現(xiàn)為血糖高、飲水量多、尿量多、體重減少的“三多一少”的特征。血肌酐在4周時(shí)有顯著升高，與假手術(shù)組比較差異有非常顯著性(P<0.01)，而在以后8、12、16周的檢測過程中雖有升高，但與假手術(shù)組比較并無顯著性差異(P>0.05)。考慮可能由于造模初期鏈脲佐菌素對腎臟的非特異性毒性作用，隨造模時(shí)間延長，毒性減少或消失，因而血肌酐恢復(fù)正常水平。本次復(fù)制的糖尿病腎病動物模型與人類糖尿病腎病臨床癥狀和化驗(yàn)指標(biāo)非常相似，提示糖尿病腎病模型復(fù)制成功。本研究4～16周的糖尿病腎病模型表現(xiàn)大量蛋白尿，而腎功能尚未受損，仍屬早期糖尿病腎病，據(jù)模型24 h尿蛋白定量和腎功能鑒定，符合糖尿病腎病Mogensen分期Ⅲ期[11]。

本研究的意義在于：選擇了成模大鼠的基礎(chǔ)指標(biāo)，包括血糖、體重、飲水量、尿量、尿蛋白、血脂、腎功能等，以及病理指標(biāo)腎小球硬化指數(shù)和細(xì)胞外基質(zhì)，提供與臨床糖尿病腎病的特點(diǎn)相符合的表現(xiàn)和數(shù)據(jù)性資料。表明STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型具有成模快，4周時(shí)已有大量蛋白尿的腎損傷表現(xiàn)，與人類糖尿病腎病高度相似，在16周內(nèi)模型穩(wěn)定，病情嚴(yán)重程度與病程相一致的特點(diǎn)。適用于藥物藥效學(xué)評價(jià)和臨床基礎(chǔ)研究。

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