小鼠α-synuclein基因內(nèi)含子1甲基化定量檢測方法的建立及不同腦區(qū)甲基化水平的比較研究

陸 璐，張 蘭，王丹慧，蔡彥寧

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室,神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100053)

眾多研究表明，α-突觸核蛋白(alpha-synuclein，α-syn)與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。例如，異常聚集和纖維化的α-syn是構(gòu)成路易體的主要成分，而后者是帕金森病(PD)和路易體癡呆的主要標(biāo)志[1]。又如，α-syn基因突變可以導(dǎo)致家族性PD[2-4]。此外，α-syn的過度表達(dá)能夠引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，進(jìn)而促進(jìn)α-syn的聚集和一系列的病理變化[5]。

α-syn的轉(zhuǎn)錄調(diào)控極為復(fù)雜并且與疾病相關(guān)。研究表明，α-syn啟動子區(qū)多態(tài)性能夠通過影響α-syn的轉(zhuǎn)錄，增加發(fā)生PD的風(fēng)險[6]。而α-syn的二倍體、三倍體均能增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄，并使罹患PD風(fēng)險增加[7, 8]。最近，α-Syn的另一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式逐漸被揭示并受到重視。多項(xiàng)研究顯示，人α-Syn內(nèi)含子1存在一個CpG島。PD患者腦組織以及PD患者外周血淋巴細(xì)胞中，該CpG島的甲基化水平顯著下降[9, 10]。該CpG島的低甲基化能夠?qū)е娄?Syn的高表達(dá)[9, 11, 12]。這些結(jié)果提示，CpG島的甲基化程度參與人調(diào)控α-Syn的表達(dá)，并與PD的發(fā)生相關(guān)聯(lián)。研究還顯示，正常腦組織中，該CpG島在皮層、紋狀體、黑質(zhì)中均高度甲基化；而PD患者腦組織中，該CpG島在皮層、紋狀體高度甲基化；在黑質(zhì)中幾乎不存在甲基化[9]。這一結(jié)果提示該CpG島的甲基化可能與PD中多巴胺能神經(jīng)元特異性損傷相關(guān)。嚙齒類動物中，α-Syn內(nèi)含子1區(qū)段同樣發(fā)揮著重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，并且該區(qū)段同樣富含CpG位點(diǎn)[13]。目前仍不明確，小鼠α-syn的轉(zhuǎn)錄是否也受內(nèi)含子1區(qū)段甲基化水平調(diào)控。闡明這一問題將有助于解析PD小鼠模型與PD患者間的異同，有助于輔助正確解讀基于PD小鼠模型的研究成果。本研究分析了小鼠α-Syn內(nèi)含子1的CpG島，建立了定量分析其甲基化水平的檢測方法，檢測了不同腦區(qū)小鼠α-Syn基因CpG島甲基化水平。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級C57BL/6雄性小鼠，2月齡10只，由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2011-0004。飼養(yǎng)條件：每日光照12 h，黑暗12 h，室溫23℃，任意攝取水食。相同時間全部處死后取小鼠新鮮腦組織并按解剖結(jié)構(gòu)分離皮質(zhì)、海馬、紋狀體及中腦并凍存于-80℃待用。實(shí)驗(yàn)全過程對動物的飼養(yǎng)與取材均遵守實(shí)驗(yàn)動物管理與保護(hù)的有關(guān)政策和規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

QIAamp DNA mini試劑盒(德國Qiagen公司)，Wizard DNA純化試劑盒(美國Promega公司)，HS Taq (日本Takara公司)，PyroMark gold Q96 reagents(德國Qiagen公司)，Streptavidin SepharoseTMBeads(美國GE公司)，Nanodrop 2000分光光度計(jì)(美國Thermo公司)，PTC-l00基因擴(kuò)增儀(美國MJ research公司)，PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀(德國Qiagen公司)。

1.3 基因組DNA的提取和偏重亞硫酸氫鹽處理

按照QIAamp DNA mini試劑盒說明書提取凍存的不同腦區(qū)小鼠組織基因組DNA。使用偏重亞硫酸氫鈉和對苯二酚對基因組DNA進(jìn)行處理,通過該處理，未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。處理過程如下，1 μg基因組DNA使用0.3 mol/L的NaOH進(jìn)行變性。而后使用新鮮配置的偏重亞硫酸氫鈉(終濃度3.0 mmol/L, pH 5.0)與對苯二酚的混合溶液(終濃度0.5 mmol/L, pH 5.0)與基因組DNA混合，石蠟油覆蓋，避光50 ℃孵育16 h。繼而使用Wizard DNA 純化試劑盒純化DNA。最后加入0.3 mol/L的NaOH在37 ℃孵育15 min結(jié)束反應(yīng)，并乙醇沉淀。

1.4 小鼠α-syn內(nèi)含子1區(qū)段CpG島分析

使用在線軟件MSPPrimer (http://www.mspprimer.org/cgi-bin/design.cgi)[14]分析小鼠α-syn基因內(nèi)含子1及其側(cè)翼序列。

1.5 焦磷酸測序引物設(shè)計(jì)

使用PyroMark assay design 2.0(德國Qiagen公司)設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測序引物。正向擴(kuò)增引物為：5’-GGGGAGAGGAGTTGATAAATTAGTTG-3’；反向擴(kuò)增引物使用Biotin標(biāo)記：5’- TCCTAATTTCCCC AATCTAATTTCA-3’；測序引物為：5’-GTGAAGG AGTTAGGGA-3’。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物長度160 bp，可以定量分析3個CpG位點(diǎn)的甲基化水平。待分析序列為：GTTAGAGYGTTYGGTAGTAGGTAGTAGAYGGTA，其中Y代表CpG位點(diǎn)。

1.6 聚合酶鏈反應(yīng)

經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為模板，使用HS Taq進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2 min； 94℃變性20 s，58℃退火20 s， 72℃延伸20 s，共50循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.7 焦磷酸測序(Pyrosequencing)

將生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與親和素標(biāo)記的微珠相混合，利用真空預(yù)處理裝置使分離純化生物素標(biāo)記的單鏈DNA，轉(zhuǎn)移入PyroMark Q96 ID測序儀中。生物素標(biāo)記的單鏈DNA作為模版，使用0.6 μmo/L測序引物，按照PyroMarkQ96使用說明書進(jìn)行測序操作。

注：(A)小鼠內(nèi)含子1及其側(cè)翼區(qū)域。其中上層方框代表外顯子，上層直線代表內(nèi)含子1；中層灰框代表CpG島區(qū)域，灰框上方灰色豎條代表內(nèi)含子1中的CpG位點(diǎn)；下層雙箭頭直線為焦磷酸測序擴(kuò)增的區(qū)域。(B)焦磷酸測序示意圖，其中灰色區(qū)域?yàn)镃pG位點(diǎn)，藍(lán)底數(shù)字顯示每個位點(diǎn)的甲基化百分比。

2 結(jié)果

小鼠α-syn基因內(nèi)含子1長度為674 bp，連同其上下游的外顯子1和2共計(jì)1 131 bp。經(jīng)在線軟件MSPPrimer分析，與人α-syn基因相似，該區(qū)段存在一個CpG島，該CpG島覆蓋了內(nèi)含子1的后半段和外顯子2的大部分(圖1A)。設(shè)計(jì)焦磷酸測序檢測，擴(kuò)增片斷長度為160 bp，電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致。使用SssI 甲基轉(zhuǎn)移酶處理并經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為模板，同樣擴(kuò)增獲得160 bp 擴(kuò)增子。而使用未經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA作為模板，無擴(kuò)增產(chǎn)物。表明擴(kuò)增條件特異(圖2)。通過焦磷酸測序能夠定量檢測3個CpG位點(diǎn)的甲基化水平。焦磷酸測序結(jié)果如圖1B所示，灰色區(qū)域?yàn)镃pG位點(diǎn)。根據(jù)焦磷酸測序中胞嘧啶的數(shù)目與胞嘧啶和胸腺嘧啶之和的數(shù)目相比即可獲得該位點(diǎn)甲基化百分比。每個CpG位點(diǎn)的甲基化百分比由儀器自動計(jì)算并顯示于CpG位點(diǎn)頂部的藍(lán)色區(qū)域。使用焦磷酸測序法對不同腦區(qū)的甲基化水平進(jìn)行檢測，如圖3所示，成年小鼠皮質(zhì)、中腦、紋狀體、海馬等四個腦區(qū)該CpG島平均甲基化水平均低于2%，不同腦區(qū)間無明顯差別。

注：不同小鼠腦區(qū)基因組DNA經(jīng)偏重亞硫酸氫鹽處理，而后作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物160 bp。SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理的基因組DNA作為陽性對照，未經(jīng)偏重亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA為陰性對照。

3 討論

DNA甲基化通過調(diào)控基因表達(dá)，影響生物生理與行為，是表觀遺傳學(xué)研究的一個重要方面[15]。近年來發(fā)展和建立了多種DNA甲基化的檢測手段，最常見的是甲基化特異性PCR和克隆測序。焦磷酸測序是一種基于即時測序的技術(shù)，可以對甲基化程度進(jìn)行精確定量。相比其他DNA甲基化檢測手段，焦磷酸測序操作簡便、結(jié)果重復(fù)性高也更加準(zhǔn)確[16]。因此本研究選擇建立基于焦磷酸測序的DNA甲基化檢測方法。

多項(xiàng)研究均表明人α-syn內(nèi)含子1區(qū)存在CpG島，人α-syn的表達(dá)受到該CpG島甲基化水平的調(diào)控，并且正常腦組織中多個腦區(qū)均呈高甲基化狀態(tài)[9-12]。我們的研究表明，盡管小鼠α-syn內(nèi)含子1區(qū)也存在CpG島，但該CpG島在所檢測的四個腦區(qū)中均呈低甲基化狀態(tài)，甲基化水平均不超過2%。這一結(jié)果與人腦組織中40-100%的甲基化水平差異明顯[9]。提示小鼠腦組織中α-syn的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制與人類存在明顯差異。與此相吻合，人及靈長類動物腦組織中α-syn表達(dá)水平隨增齡而增加[17]，而在嚙齒類中α-syn表達(dá)量隨增齡而減少[18]。這種差異很可能與α-syn內(nèi)含子1CpG島甲基化調(diào)控存在關(guān)聯(lián)。本研究對于指導(dǎo)選擇合適的動物和細(xì)胞模型也具有重要意義。例如，有研究顯示DNA甲基化酶抑制劑能夠上調(diào)α-syn的表達(dá)，從而加強(qiáng)MPP+以及6-OHDA等毒素的毒性[12]。研究者認(rèn)為DNA甲基化酶抑制劑可能是治療PD的靶點(diǎn)。而我們的結(jié)果提示小鼠以及小鼠來源的細(xì)胞，由于其中α-syn的表達(dá)不受DNA甲基化的調(diào)控，可能不適合該項(xiàng)目的后續(xù)研究。

圖3 不同小鼠腦區(qū)α-syn內(nèi)含子1CpG島甲基化百分比

總之，本研究建立了定量分析小鼠α-syn內(nèi)含子1CpG島甲基化水平的焦磷酸測序方法。本研究還提示小鼠與人α-syn的表觀遺傳調(diào)控存在明顯差異。

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