應(yīng)用微衛(wèi)星和下頜骨形態(tài)分析法對不同昆明小鼠種群進行遺傳分析

韓喜彬，王立辛，蘇玉虹，巴彩鳳

(1.遼寧醫(yī)學院實驗動物中心，錦州 121001； 2.遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，錦州 121001)

昆明(KM)小鼠中國應(yīng)用廣泛的封閉群實驗小鼠，在科研、教學和檢定實驗中被大量使用，經(jīng)過多年繁育不同單位的種群攜帶著或多或少改變的基因位點，這種變化位點的累計最終會導(dǎo)致具體的性狀改變，使實驗數(shù)據(jù)的重復(fù)性大大降低，所以急需對KM小鼠乃至所有封閉群動物建立遺傳學標準，通過遺傳監(jiān)測使其保持遺傳穩(wěn)定性[1]。國內(nèi)實驗動物學界已經(jīng)意識到昆明小鼠的遺傳質(zhì)量問題，較早的報道證明了不同來源的KM小鼠在體型特征、血液指標和實驗反應(yīng)特性等方面存在差別[2-4]；而近年以STR分析KM小鼠遺傳特征的報道較多，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同種群之間存在中等或較大程度的遺傳背景差異[5-7]。遺傳控制的關(guān)鍵在于遺傳的穩(wěn)定性，即群體基因的數(shù)量和基因型頻率始終保持不變，從而貯藏現(xiàn)存的遺傳雜合性，從這一角度考量基因水平的監(jiān)測必不可少，另外，動物實驗是針對個體表型的測量和觀察，遺傳控制的結(jié)果是表型穩(wěn)定，所以必須測量宏觀指標。本研究選擇微衛(wèi)星法和下頜骨形態(tài)法對KM小鼠進行遺傳分析，將遺傳的內(nèi)因、外因相結(jié)合，以期為封閉群動物的遺傳學標準建立提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

昆明小鼠60只，(20±1)g，雌雄各半，SPF級。30只購自中國醫(yī)科大學實驗動物部8周齡昆明小鼠(SCXK(遼)2008-0005，簡稱A種群)；30只購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心(SCXK(遼)2008-0002，簡稱B種群)。兩個昆明小鼠種群都引種自北京國家嚙齒類實驗動物種子中心，封閉時間8年以上。實驗完成于遼寧醫(yī)學院實驗動物中心(SYXK(遼)2008-0004)。

1.2 實驗方法

1.2.1 下頜骨形態(tài)分析：下頜骨測量位點參照Festing[8]建立的方法，共利用11個變異函數(shù)，1～6為高度測量點，7～11為長度測量點，均為右側(cè)下頜骨(支)；標本制作過程為煮沸3 min，胰酶37℃消化24 h，清水洗凈，拔掉門齒，以黑色背景掃描成圖像，再以Photoshop 8.0分析圖像獲得數(shù)據(jù)(圖1)。

(1～6為高度變量，7～11為長度變量)

1.2.2 微衛(wèi)星檢測：常規(guī)酚氯法提取基因組DNA，參考小鼠基因組數(shù)據(jù)庫 (http://www.informatics.jax.org)及本實驗室之前的研究結(jié)果[9]，選取10個分布在不同染色體的微衛(wèi)星位點，每個位點多態(tài)信息豐富，引物序列見表1。優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，AgNO3染色，根據(jù)泳動距離進行結(jié)果判讀，泳動距離最長的帶設(shè)為英文字母a，依次為b、c等，泳動距離一致的為單態(tài)性(單一條帶)，若有差異即為多態(tài)性(多個條帶)。所用試劑均購自大連寶生物公司。平均雜合度(he)、平均多態(tài)信息含量(PIC)和遺傳距離(DA)分析分別按Nei(1974)、Bosein(1980)和Nei(1983)計算(如下)。

1.2.2.1 平均雜合度、多態(tài)信息含量

式中n為特定基因位點上的等位基因數(shù)，Pi、Pj分別等于等位基因的頻率，he為雜合度。

1.2.2.2 遺傳距離

式中：

Xij—X群體中第j個座位上第i個等位基因的頻率；

Yij—Y群體中第j個座位上第i個等位基因的頻率；

表1 微衛(wèi)星位點引物序列及反應(yīng)條件

mj— 第j個座位上的等位基因數(shù)；

r— 檢測的座位數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理：采用SPASS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 下頜骨形態(tài)分析結(jié)果

下頜骨變量測量結(jié)果見表2、圖2。兩單位KM小鼠種群11項參數(shù)中有5個參數(shù)差別明顯，B種群2項高度參數(shù)X4、X5，2項長度參數(shù)X9、X10都大于A種群，差異極顯著 (P﹤0.01)，A種群只有高度參數(shù)X6大于B種群，達到差異顯著(P﹤0.05)，說明兩個種群小鼠的下頜骨形態(tài)存在一定差別。

表2 KM小鼠下頜骨參數(shù)測量結(jié)果

圖2 KM小鼠下頜骨掃描圖像

2.2 微衛(wèi)星檢測結(jié)果

10個微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果見表3、圖3。兩家單位共檢測出28個等位基因、31個基因型，最多等位基因數(shù)4個，最少1個，平均雜合度(he)0.472，平均多態(tài)信息含量(PIC)0.382。A種群KM小鼠共檢出27個等位基因、28個基因型、平均雜合度0.525、平均多態(tài)信息含量0.402；B種群KM小鼠共檢出26個等位基因、27個基因型、平均雜合度0.418、平均多態(tài)信息含量0.361。兩個種群在D2NDS3等5個位點基因型分布不同，A種群的遺傳多樣性略高于B種群，兩個種群遺傳距離為0.076。

3 討論

在KM小鼠等封閉群動物的繁育過程中，遺傳污染、基因突變和選擇壓都能造成遺傳差異，這種差異體現(xiàn)在異地種群間，也體現(xiàn)在同一種群相隔較遠的代次間，遺傳監(jiān)測的價值在于及時、盡早地發(fā)現(xiàn)這些變化，在這些變化固定下來之前對種群進行調(diào)整，避免基因分布的改變。本研究以微衛(wèi)星法和下頜骨分析法獲得了兩個單位KM小鼠的遺傳學數(shù)據(jù)，兩個種群的個別位點和形態(tài)參數(shù)差別明顯，說明兩個種群的分化是存在的，根據(jù)此結(jié)果無法說明種群合格與否，因為至今沒有形成KM小鼠封閉群的定性或定量標準，檢測結(jié)果只能說明其遺傳特征。在國內(nèi)的相關(guān)研究報道中，能夠?qū)Ψ忾]群動物的遺傳學指標做出明確說明的不多，其中吳艷花等、李薇等以微衛(wèi)星技術(shù)對國內(nèi)遺傳背景明確的幾個小型豬、長爪沙鼠的種群遺傳特征進行了分析，并以群體平均雜合度或平衡狀態(tài)做為群體合格與否的指標[10，11]。其他以微衛(wèi)星技術(shù)檢測實驗大鼠或小鼠遺傳結(jié)構(gòu)的報道并不罕見，檢測結(jié)果不但能說明群體遺傳概貌，也能區(qū)分一些品系[12，13]；以遺傳監(jiān)測為目的的下頜骨形態(tài)學檢測方面的報道很少，陳哲等通過對3種白化小鼠下頜骨變量的研究，探討了其在品系鑒別中的應(yīng)用價值[14]，吳宿慧等探討了下頜骨測量技術(shù)在性別鑒定中的作用[15]，這些研究豐富了封閉群實驗動物的遺傳學數(shù)據(jù)，雖然未能建立標準，也具備一定參考價值。

表3 KM小鼠10個微衛(wèi)星位點檢測結(jié)果

1：ab；2：aa；3：ac；4：ac；5：ac；6：ab

現(xiàn)今世界范圍內(nèi)被承認的通用標準封閉群有美國Charles River Laboratories CD-1種群(ICR小鼠和SD大鼠)以及日本CLEA的Wistar大鼠種群，兩個機構(gòu)基礎(chǔ)群的建立方法相同，都取自遺傳背景明確的多個種群，力求建立該品系完整基因庫，再選擇恰當?shù)谋O(jiān)測方法，在長期的繁育過程中確定具體的監(jiān)測指標和操作規(guī)程，并以此方法指導(dǎo)選種、留種和遷移等。KM小鼠在我國分布廣泛，各地種群遺傳差異大，分化明顯，更為重要的是遺傳背景不明確，所以，目前各個單位有必要對各自種群進行連續(xù)的監(jiān)測，完善基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為KM小鼠遺傳學監(jiān)測標準的建立打下基礎(chǔ)，讓這個具有中國特色的品系穩(wěn)定延續(xù)，并可促進我國實驗動物標準化事業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論

兩個KM小鼠種群存在基因結(jié)構(gòu)和表型特征的差異，群間輕度遺傳分化。

參考文獻：

[1] 朱玉峰, 王元占, 楊培梁, 等. 封閉群大小鼠國際遺傳標準化 [C]. 第五屆中南地區(qū)實驗動物科技交流年會, 2005.

[2] 張周, 徐永平, 夏春梅. 不同來源KM小鼠在藥物抑瘤作用重復(fù)實驗中的結(jié)果差異原因初探 [J]. 上海實驗動物科學, 2000, 20(4 ):240 -241.

[3] 李洪濤, 杜春燕, 章金濤, 等. 兩個昆明小鼠封閉群部分生物學特性的比較[J]. 河南醫(yī)科大學學報, 2000, 35(4):318-319.

[4] 趙國際, 陳國強, 朱冬琴, 等. 中國6個KM小鼠群體外形形態(tài)特征調(diào)查 [J]. 上海實驗動物科學, 2001, 21(4):239-240.

[5] 班建榮, 胡芹寶, 張新創(chuàng). 兩個封閉群SPF級昆明小鼠遺傳背景調(diào)查[J]. 微生物學免疫學進展, 2013, 41(5):6-9.

[6] 商海濤, 魏泓, 岳秉飛, 等. 應(yīng)用微衛(wèi)星標記對三個昆明小鼠封閉群的遺傳學研究[J]. 實驗動物科學，2009, 26(2):1-6.

[7] 張建琴, 申士小, 任連生, 等. 微衛(wèi)星座位對KM封閉群小鼠的遺傳分析[J]. 四川動物, 2008, 27(5):791-793.

[8] Festing M, Staats J. Standardized nomenclature for inbred strains of rats. Fourth listing [J]. Transplantation, 1973, 16:221-245.

[9] 王立辛, 韓喜彬, 蘇玉虹. KM小鼠和ICR小鼠遺傳特征分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學, 2012, 28(35):19-24.

[10] 吳艷花, 徐玲玲, 杜小燕, 等. 封閉群實驗用小型豬遺傳標準的建立[J]. 實驗動物科學, 2010, 27(6):33-35.

[11] 李薇, 江其輝, 杜小燕, 等. 封閉群長爪沙鼠遺傳標準的建立[J]. 實驗動物科學, 2010, 28(2):31-34.

[12] 謝建云, 馮潔, 胡建華. 微衛(wèi)星標記在近交系及封閉群小鼠遺傳質(zhì)量檢測中的初步應(yīng)用[J]. 上海交通大學學報: 農(nóng)業(yè)科學版, 2008, 26(4):290-295.

[13] 王洪, 岳秉飛, 劉雙環(huán), 等. 小鼠11個品系20個微衛(wèi)星基因位點的遺傳分析[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2006, 3(16):136-137.

[14] 陳哲, 趙琳, 陳曉, 等. KM、BALB/c和ICR小鼠下頜骨形態(tài)變量的初步探討[J]. 上海實驗動物科學，2004, 24(4)：221-224.

[15] 吳宿進, 趙曉進, 胡春紅, 等. KM、ICR、BALB/c小鼠下頜骨形態(tài)變量性差分析[J]. 河南師范大學學報 (自然科學版), 2005, 33(4):126-128.