低鉀型周期性麻痹相關的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的構建

雍曾花，徐宏燕，王大鵬，王曉英，姚合斌,

(1.安徽醫科大學海軍臨床學院，北京 100048；2.解放軍海軍總醫院基礎醫學研究中心，北京 100048；3.解放軍海軍總醫院內分泌科，北京 100048)

低鉀型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis，HypoPP)是一組以反復短暫發作性肌無力伴隨血清鉀降低為特征的常染色體顯性遺傳性離子通道疾病。其中，家族性低鉀型周期性麻痹(familial hypokalemic periodic paralysis，FHypoPP)為最常見的形式，主要涉及的離子通道基因有CACNA1S、SCN4A和KCNE3 (分別編碼骨骼肌電壓門控L-型鈣通道α1亞單位CaV1.1、鈉通道α亞單位NaV1.4和鉀通道輔助亞單位MiRP2)。HypoPP患者具有基因異質性，有研究報道HypoPP患者中CACNA1S基因突變最常見[1]。目前，HypoPP的發病機制尚不十分清楚。因受人體試驗的倫理學限制，構建動物模型用于研究人類疾病已成為國際趨勢。而99%的小鼠基因與人類基因組同源[2]，目前已成為研究哺乳動物尤其是人類基因功能的最常用且能夠實現定點突變的模式生物[3]。因此，我們選擇代表性好、發病癥狀重的CaV1.1 Arg528His(R528H)突變，運用同源重組和胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES細胞)技術構建了Cchl1a3基因(與人類CACNA1S基因對應)R528H突變的HypoPP敲入小鼠模型，為在整體動物水平研究發病機制和病理生理提高良好的平臺。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 打靶載體及實驗動物

Cchlla3-knock-in打靶載體上海南方模式生物研究中心保存；SPF級C57BL/6J雌鼠，體重18～19 g，來自上海南方模式生物研究中心【SCXK(滬)2009-0023】。實驗在上海南方模式生物研究中心屏障動物實驗設施進行【SYXK(滬)2008-0035】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞及培養基

來源于129S6/SV品系小鼠的ES細胞由上海南方模式生物研究中心保存。DMEM培養基、胎牛血清、G418、Ganciclovoir(均為Gibco BRL公司產品，美國)、LIF(Chemicon公司，美國)、青鏈霉素、胰蛋白酶(均為Sigma公司產品，美國)。

1.1.3 酶及試劑

Wizard Genomic DNA純化試劑盒(Promega公司，美國)；Taq DNA聚合酶，dNTP及限制性內切酶(TaKaRa公司，日本)；PCR引物(上海英俊生物技術有限公司和上海生工生物工程有限公司合成)；瓊脂糖粉(Oxoid公司，英國)；DNA Marker(深圳晶美生物技術有限公司)。

1.1.4 主要儀器

電轉儀(Bio-Rad公司，美國)；顯微注射平臺(Olympus公司，日本)；PCR儀(Eppenddorf AG22331 Hamburg，德國)；DNA測序儀(ABI公司 Prism 377，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cchl1a3-knock-in打靶載體的構建

以Cchl1a3基因為模板設計引物，擴增套取同源臂并定向插入到pBR322質粒，并利用Red/ET介導的同源重組從含有Cchl1a3基因的細菌人工染色體中套取包含目的基因的片段。PCR擴增含有目的突變的同源臂并將其插入PL451質粒的Frt-neo-Frt片段兩側，再與攜帶Cchl1a3基因的pBR322- Cchl1a3質粒經同源重組后，在Cchl1a3基因片段內實現目的定點突變G→A，并插入neo篩選基因和Flp重組酶特異性識別位點Frt，從而獲得Cchl1a3-knock-in打靶載體。該載體構建已在課題組的前期工作中完成[4]。

1.2.2 ES細胞的電轉化及藥物篩選

取處于對數生長期的ES細胞經0.125%胰蛋白酶-EDTA消化并計數，加適量的PBS使細胞密度達到約1.5×107/mL。取0.8 mL上述ES細胞懸液，加入約35 μg經Not I線性化的Cchl1a3-knock-in質粒DNA，混勻后以電壓為240 V、電容為500 μF的電參數進行電穿孔，電轉后的細胞重新懸浮后平均分配到3個已鋪好滋養層細胞10 cm盤培養皿中培養。電穿孔24 h后換含有選擇藥物G418(300 mg/L)和Ganciclovoir(2 umol/L)的培養液進行選擇性培養，每天更換培養液，8～10 d后可發現肉眼可見的抗性ES細胞克隆并進行挑取。

1.2.3 PCR法和DNA測序法鑒定同源重組ES細胞克隆

挑取的ES細胞克隆經消化、吹打后轉移至96孔培養板中培養，部分凍存，部分用于提取基因組DNA。根據Cchlla3基因敲入載體構建策略(圖1)設計特異性的PCR引物，進行PCR擴增篩選獲得的ES細胞克隆是否發生雙臂同源重組。其中，5’短臂上游引物P1為5’-TCACGCCACCCCTTCC ATGAACACA-3’(gene site: 39729-39753)，位于5’短臂外；下游引物P2為5’-CCTCCCCCGTGCCT TCCTTGAC-3’，位于neo重組區域，應擴增出2340 bp的片段。3’長臂上游引物P3為5’-CTGA GCCCAGAAAGCGAAGGA-3’，位于neo重組區域；下游引物P4為5’-CCCGTCCCCTTTTGGTGCAT AGTGC-3’ (gene site: 48770-48746)，位于3’長臂外，應擴增出7511 bp的片段。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。進一步對PCR產物進行DNA測序，明確有無突變。

1.2.4 ES細胞的囊胚注射及胚胎移植獲得Cchl1a3基因R528H敲入嵌合小鼠并鑒定

囊胚來源于自然受孕并發育至囊胚階段的C57BL/6J小鼠，將陽性ES細胞克隆顯微注射到小鼠囊胚中，每枚囊胚中注射15個左右ES細胞。將注射后囊胚培養于無LIF的DMEM完全培養基中，37℃，5% CO2條件下培養1 h左右，再移植到2.5 d假孕母鼠子宮中，每側移植8～10枚，自然分娩，產下的后代若毛色與ES細胞來源小鼠(129S6/SVEV灰褐色)相同，說明該鼠是有ES細胞整合的嵌合體小鼠。對該灰色小鼠經提取尾基因組DNA進行PCR鑒定(鑒定策略同上)，是否攜帶打靶后的突變基因。

1.2.5 Cchlla3基因R528H敲入去neo小鼠的獲得及鑒定

再將嵌合體小鼠與C57BL/6J小鼠交配，獲得雜合子小鼠并與攜帶Flp重組酶的FLP小鼠交配繁育，獲得的子代小鼠可被位點特異性重組切除neo基因和1個Frt位點，為雜合的Cchlla3基因R528H敲入去neo小鼠。用PCR法鑒定子代小鼠是否發生去neo反應。根據Cchlla3基因敲入去neo小鼠基因組鑒定策略(圖2)設計特異性的PCR引物。其中，5’短臂上游引物P1同上，下游引物P5為5’-TAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCC-3’，位于重組區域，產物大小為2116 bp；3‘長臂上游引物P6為5’-CCGGATCCACCTAATAACTTCGTAT-3’，位于重組區域，下游引物P4同上，產物大小為7165 bp。反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。再對PCR產物行DNA序列測定進一步證實，其Cchlla3基因突變(G→A)和敲入的基因片段的重組位點是否正確。

圖1 Cchl1a3基因R528H敲入載體的構建策略

圖2 Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠基因組鑒定策略

1.2.6 繁殖獲得Cchlla3基因R528H敲入去neo純合小鼠及初步表型分析

Cchlla3基因R528H敲入去neo雜合子小鼠交配得到純合的Cchlla3基因敲入去neo小鼠。然后對這些小鼠進行PCR及DNA測序進一步確定目的突變是否存在。Cchlla3基因敲入去neo純合子小鼠PCR鑒定的上游引物P7為5’-CGCTTCGACTGCTTCGTGGTGTGC-3’，下游引物P8為5’-CCCGTGTTCATGCCAAAGCTGGGC-3’。純合子小鼠應為870 bp的片段，而野生型小鼠應為748 bp的片段。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。再對PCR產物進行DNA測序進一步證實目的突變是否存在，并對該純合子小鼠的外觀、活動及生長發育等方面進行觀察。

注：m：DNA marker；-：陰性對照；1-9：同源重組 ES細胞克隆。

2 結果

2.1 同源重組ES細胞克隆的篩選及鑒定

將線性化Cchl1a3-knock-in載體電轉染到ES細胞中。經過G418和Ganciclovoir篩選培養8 d后發現并挑取96個藥物抗性ES細胞克隆，提取其基因組DNA樣本并進行PCR鑒定。結果顯示有9個ES細胞克隆的5’短臂擴增產物長2.3 kb，3’長臂擴增產物長7.5 kb，提示雙臂發生同源重組(圖3)。因突變位點靠近5’短臂，進一步對這9個ES細胞克隆的5’短臂PCR產物進行DNA測序，結果驗證目的突變位點正確，測序結果(圖4)。

2.2 陽性ES克隆囊胚注射結果

通過顯微囊胚注射共完成了250枚胚胎，并移植到2.5 d假孕母鼠子宮中，制作了13只受體。假孕母鼠飼養于上海南方模式生物研究中心SPF級動物房，自然分娩，產下15只小鼠。其中7只為嵌合度>50%的嵌合體雄性小鼠，它們的毛色呈灰褐色，與ES細胞來源的灰褐色129品系小鼠相同，也說明了外源的ES細胞已整合入生殖細胞，該嵌合體小鼠是種系嵌合體小鼠(彩插2圖5)。

2.3 Cchl1a3基因R528H敲入去neo雜合小鼠的獲得及鑒定

將嵌合體小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得雜合子小鼠，再將該雜合子小鼠和FLP小鼠交配繁育，獲得15只子代并對其進行PCR鑒定，結果顯示其中9只小鼠(4雄，5雌)發生了去neo反應，即5’短臂擴增片段長度為目標的2.1 kb，3’長臂擴增片段長度為目標的7.2 kb。9只小鼠基因組DNA的PCR電泳結果(圖6)。經DNA序列測定也證實了Cchlla3基因突變(G→A)和敲入的基因片段的重組位點是正確的。

2.4 純合的Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠的獲得及表型分析

將雜合的Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠交配，獲得的子代小鼠中野生型、雜合子和純合子的比例符合孟德爾遺傳定律。對子代小鼠鼠尾基因組DNA進行PCR鑒定，結果顯示15只小鼠的基因組DNA擴增片段長度為870 bp，為純合子Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠，而對照的野生型小鼠DNA擴增片段長度為748 bp(圖7)。從這15只小鼠中隨機抽取5只行DNA序列測定，結果也證實了該小鼠為攜帶Cchl1a3基因G→A突變的純合子小鼠(彩插2圖8)。純合子小鼠發育至性成熟時精神、飲食及活動狀態良好，但是在4個月齡時從背部開始出現脫毛和皮膚破潰，逐漸累及整個軀干，再延伸至頭部及四肢，甚至出現死亡(彩插3圖9)。

注：(a)箭頭標記處為目的突變對應的反向突變位點C→T；(b)方框標記處為目的突變對應的反向突變位點C→T。

注：m：DNA marker；1，2，5，6，8，10，12，14，15：同源重組 ES細胞克隆。

注：m：DNA marker；-：野生型小鼠； 1-15：去neo基因純合子小鼠。

3 討論

Cchlla3基因編碼小鼠骨骼肌L 型電壓依賴型鈣通道的a1亞基，與人類的CACNA1 S基因編碼的氨基酸序列92%相同。在已發現的HypoPP突變位點中，人類和小鼠的氨基酸也完全相同，顯示了它們在功能上的高度一致性。2008年，Hayward等[5]建立了表達SCN4A基因Met1592Val突變的小鼠，用于研究高血鉀周期性麻痹(HyperKPP) 的模型。Wu等[6]又構建了SCN4A基因R669H突變敲入小鼠，用于研究HypoPP神經肌肉電生理的變化，也取得了一定的進展。HypoPP患者嚴重時可因呼吸肌麻痹或低血鉀導致的惡心心律失常而危及生命。據Jurkat-Rott[7]報道，36個HypoPP家族中有15人死于本病發作，中位年齡僅22歲。鑒于這是一種危害嚴重的疾病, 建立與人類HypoPP具有相似遺傳特征的點突變小鼠模型來研究該病的發病機制具有極高的價值。

在HypoPP患者已知突變中，CACNA1S基因R528H突變的地域分布最廣，突變頻率最高，具有代表性。因此，在前期工作中我們根據Liu[8]等和Chan[9]等人的方法，運用現在常用的Red/ET重組技術和Flp-FRT重組酶系統構建了Cchl1a3基因R528H突變打靶載體[4]。本研究基于neo(正選擇標記基因)和HSV-tk(負選擇標記基因)基因的正負篩選策略，通過ES細胞基因打靶獲得9個同源重組克隆，PCR和DNA序列測定均證實Cchl1a3基因內實現R528H定點突變并插入篩選基因和重組酶特異性識別位點。同源重組ES細胞克隆經顯微注射、嵌合體育種獲得了低鉀型周期性麻痹相關的Cchl1a3基因R528H突變純合子敲入小鼠模型，精確模擬CACNA1S基因第11號外顯子上的R528H突變。本研究是國內首個成功構建的攜帶Cchl1a3基因R528H突變的敲入小鼠模型，不僅可以解決研究材料稀缺、代表性差的問題，還可以避免了在人體實驗材料以及實驗技術不可操作性的限制。

通過表型觀察到去neo純合子小鼠在性成熟前精神狀態良好，飲食及活動與正常小鼠無差異，但在4個月齡時逐漸出現脫毛，皮膚破潰甚至死亡。經過加強環境消毒、墊料更換等處理，該純合小鼠的皮膚狀況沒有明顯改善，我們認為這可能與該小鼠殘留有部分外源性基因有關。本研究中，雜合子小鼠與表達Flp重組酶的小鼠雜交后，攜帶的Frt-neo-Frt篩選基因片段被位點特異性重組切除neo基因和1個Frt位點，以減少對內源基因表達的影響。這是一種去除選擇基因的有效方法，但仍在Cchl1a3基因11內含子中殘留122 bp的外源性堿基。目前常用的基因敲入方法尚不能完全避免這種殘留的重組靶點區[10-11]，但未涉及類似情況。本研究中，Frt-neo-Frt片段位于Cchl1a3基因11內含子中，而該內含子序列及殘留序列經過網上比對發現并無編碼功能，但也不能完全排除殘留基因對轉錄后剪切加工的影響。此外，小鼠皮膚潰爛多因循環障礙和神經功能障礙導致，但是因該小鼠數量的限制，尚未對其進行肌肉電生理變化，或是血液指標等檢測，我們還需進一步研究解釋該現象。

HypoPP患者平時并不發病，而本研究的純合子小鼠在沒有預處理的情況下并沒有出現肌肉麻痹、四肢癱瘓等HypoPP的典型表現，與該病患者相一致。目前，HypoPP只在統計學上與基因突變具有相關性，但關于相關基因突變的功能學研究甚少，突變導致低血鉀的分子機制仍不十分清楚。HypoPP患者發病前常伴有明顯的誘因，如劇烈活動、高碳水化合物飲食、酗灑、寒冷、勞累、上呼吸道感染、大量輸入葡萄糖等。多數研究認為HypoPP患者的發作主要與胰島素、甲狀腺素、腎上腺素等內源性激素水平有關[12-15]。同時，在以往對HypoPP小鼠模型的研究中，只觀察到突變小鼠在外源的低血鉀環境下具有HypoPP發病時的肌肉電生理特征，但并沒有出現自發性的低血鉀。因該疾病需要在上述條件下誘發出現低血鉀，本研究中并未對正常情況下的純合小鼠進行血鉀的檢測，該部分數據有待進一步補充。此外，我們將在Cchlla3基因R528H突變敲入小鼠模型的基礎上，給予各種激素處理并進行表型分析，以期證實該突變小鼠能夠出現自發性低血鉀等表現，精確模仿人類HypoPP的發病。這樣不僅可以發現CACNA1S突變致HypoPP的分子機制，還可以在CACNA1S功能的基礎研究上有新的突破，為改進防治措施和藥物研發提供基礎。

致謝 本實驗得到海軍總醫院中心實驗室周麗君研究員的悉心指導和技術幫助，對此表示感謝。

參考文獻：

[1] SternbergD，MaisonobeT，Jurkat-Rott K，etal．Hypokalaemic periodic paralysis type2 caused by mutations at codon672 in the muscle sodium channel gene SCN4A [J]. Brain, 2001, 124(Pt 6):1091-1099.

[2] Wang X, Gao G, Guo K,etal. Phospholemman modulates the gating of cardiac L-type calcium channels [J]. Biophys J, 2010, 98(7):1149-1159.

[3] 傅繼梁，主編. 基因工程小鼠[M].上海:上海科學技術出版社, 2006: 4-20.

[4] 姚合斌，高榮凱，王曉英，等.應用同源重組技術構建小鼠Cchlla3基因R528H突變型打靶載體的策略[J]. 海軍總醫院學報,2010, 23(2): 65-69.

[5] Hayward LJ, Kim JS, Lee MY,etal. Targeted mutation of mouse skeletal muscle sodium channel produces myotonia and potassium-sensitive weakness[J].J Clin Invest, 2008, 118(4): 1437-1449.

[6] Wu F, Mi W, Burns DK,etal. A sodium channel knockin mutant (NaV1.4-R669H) mouse model of hypokalemic periodic paralysis [J]. J Clin Invest, 2011, 121(10):4082-4094.

[7] Jurkat-Rott K, Weber MA, Fauler M,etal. K+-dependent paradoxical membrane depolarization and Na+overload, major and reversible contributors to weakness by ion channel leaks [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(10): 4036-4041.

[8] Liu P, Jenkins NA, Copeland NG. A highly efficient recombinerring-based method for generating conditional knockout mutations [J]. Genome Res, 2003, 13(3):476-484.

[9] Chan W, Constantino N, Li R,etalA recombineering based approach for high-throughput conditional knockout targeting vector construction [J]. Nucleic Acids Res, 2007, 35(8):e64.

[10] 王莧，段海清，張兆山.ET重組Escherichia coli中最新分子克隆方法[J]．軍事醫學科學院院刊,2002, 26(4): 289-293.

[11] Roebroek AJ, Gordts PL, Reekmans S. Knock-in approaches [J]. Methods Mol Boil, 2011, 693: 257-275.

[12] 諸葛寶忠.低鉀性周期性麻痹患者紅細胞膜Na+-K+-ATPase活性變化及相關激素研究[J].醫學檢驗與臨床, 2006, 17(2): 23-25.

[13] Soonthornpun S, Setasuban W, Thamprasit A. Insulin resistance in subjects with a history of thyrotoxic periodic paralysis (TPP) [J]. Clin Endocrinol (Oxf).2009, 70(5):794-797.

[14] Kalita J, Goyal G, Bhoi SK,etal. Comparative study of thyrotoxic periodic paralysis from idiopathic hypokalemic periodic paralysis: An experience from India [J]. Ann Indian Acad Neurol. 2012, 15(3):186-190.

[15] Yeh FC, Chiang WF, Wang CC,etal. Thyrotoxic periodic paralysis triggered by beta2-adrenergic bronchodilators[J]. CJEM.2013, 15:1-5.