腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染病原和分子診斷

高正琴，賀爭鳴，關偉鴻

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

糞類圓線蟲(Strongyloidesstercoralis)是一種自生和寄生世代交替的兼性寄生蟲，也是一種機會致病性腸道線蟲。機體感染后，成蟲寄生于消化道，當宿主免疫力正常時，該蟲經自身感染方式造成長期寄生可達數十年之久而不表現明顯致病癥狀，但當宿主免疫功能低下時，幼蟲可侵入肺、肝、腦、腎等器官，引起糞類圓線蟲病(strongyloidiasis)，甚至死亡[1-4]。至今尚未見腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染的報道。本文首次對腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染進行了病原和分子診斷。現報告如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

腫瘤移植裸鼠(不明原因突發死亡)來自中國某藥物研究機構。

1.2 病原診斷

將腫瘤移植裸鼠剖檢發現：結腸水腫，收集水腫液多達2 mL。肉眼可見空腸內有數條細小線蟲在內容物中蜿蜒游動。取結腸水腫液、空腸內容物涂片，實時動態顯微視頻攝錄結果。

1.3 二重PCR分子診斷

針對糞類圓線蟲act-2和btub基因設計引物。SSact-2F：5′-GATTATCGTAGTGAGAGGACGTGTAG AGATAATAAA-3′；SSact-2R：5′-CGGCAACCTCTTC GTCACACATTTTCTATAGCAAGT-3′；片段長度1183 bp。SSbtubF：5′-ATGAGAGAAATTGTTCACGTCCAA ACCGGCCAATGT-3′；SSbtubR:5′-TTTTTTTTTTTTT TTTTTGCAAGATAATAGTTTAAT-3′；片段長度1460 bp。收集腫瘤移植裸鼠結腸水腫液、空腸內容物中糞類圓線蟲，用德國Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按說明書操作抽提DNA。以抽提的DNA為模板，同時用剛地弓形蟲、賈第鞭毛蟲、蠕形住腸線蟲DNA作為糞類圓線蟲二重PCR擴增時的陰性對照。PCR總反應體系為50 μL，包括10×Buffer (Mg2+ Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、正反向引物(20 pmol/μL)各1.0 μL、EX Taq(5U/μL)0.5 μL、模板DNA 1 μL、nuclease-free water 37.5 μL。循環參數：95℃ 1 min 1；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環；72℃ 7 min 1個循環。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

2 結果

2.1 病原學診斷結果

2.1.1 腫瘤移植裸鼠結腸水腫液涂片鏡檢結果：采集腫瘤移植裸鼠結腸水腫液低速離心，取適量沉淀用生理鹽水直接涂片，實時動態顯微視頻攝錄結果：可見數條異常活躍、呈蛇形浮游的線蟲幼蟲，呈C型或反S型，蟲體外觀無色透明，頭端鈍圓，尾部尖細，長約0.3 mm，具有雙球型咽管(圖1)。依據蟲體形態，鑒定為糞類圓線蟲桿狀蚴[5-6]。

圖1 腫瘤移植裸鼠結腸水腫液中糞類圓線蟲桿狀蚴

2.1.2 腫瘤移植裸鼠空腸內容物涂片鏡檢結果：取腫瘤移植裸鼠空腸內容物，用生理鹽水直接涂片，實時動態顯微視頻攝錄結果：可見大量無色透明、運動活潑、呈蛇形游走樣線蟲蟲體，長約2.2 mm，寬0.03 mm，蟲體半透明，體表具細橫紋，口腔短，咽管細長，約為體長的1/3(圖2)，尾端尖細，末端略呈錐形，生殖器官為雙管型，肛門位于距尾端1/3處的腹面(圖3)。依據蟲體形態，鑒定為糞類圓線蟲寄生世代雌蟲[5-6]。

圖2 腫瘤移植裸鼠空腸內容物中糞類圓線蟲寄生世代雌蟲頭端

圖3 腫瘤移植裸鼠空腸內容物中糞類圓線蟲寄生世代雌蟲尾端

2.2 分子生物學診斷結果

在糞類圓線蟲感染腫瘤移植裸鼠結腸水腫液、空腸內容物樣本中均檢測出糞類圓線蟲act-2和btub基因特異性DNA片段(大小分別為1183 bp和1460 bp)，而作為陰性對照的剛地弓形蟲、賈第鞭毛蟲、蠕形住腸線蟲卻未觀察到目的基因片段擴增。腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲二重PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4。糞類圓線蟲二重PCR擴增獲得了清晰特異的act-2和btub目的條帶，分子診斷結果確診了腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染。

注：泳道1-2：糞類圓線蟲感染裸鼠結腸水腫液樣本act-2基因特異性PCR產物；泳道6-7：糞類圓線蟲感染裸鼠空腸內容物樣本btub基因特異性PCR產物；泳道3-5和泳道8-10：陰性對照：剛地弓形蟲、賈第鞭毛蟲、蠕形住腸線蟲。

3 討論

糞類圓線蟲最先由Normand于1876年在越南境內一患腹瀉法國士兵的糞便中發現，而后在尸檢時又在腸道、膽管、胰管中發現許多線蟲，但形態與糞便中的蟲體不同。后經眾多學者的不斷研究后認為其為同一蟲種的不同發育階段，并對其生活史及侵入人體的途徑和在人體內的移行有了進一步的研究。惡性腫瘤、器官移植、造血干細胞移植、HIV感染、使用皮質類固醇藥物增加糞類圓線蟲機會性感染的風險，未及時發現治療者死亡率較高[7-12]。

本研究首次對腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染進行了病原和分子診斷。作者首先在腫瘤移植裸鼠結腸水腫液和和空腸內容物直接涂片中發現了糞類圓線蟲的幼蟲(桿狀蚴)和成蟲(雌蟲)，此類報道實屬罕見。首次應用實時動態顯微視頻攝錄技術跟蹤監測寄生蟲，獲得了糞類圓線蟲幼蟲和成蟲典型特征形態及獨特運動方式的寶貴視頻資料。應用二重PCR技術，從分子水平上對腫瘤移植裸鼠感染的糞類圓線蟲進行多基因特征確認，為快速準確鑒別診斷糞類圓線蟲感染提供新的思路。

裸鼠先天性無胸腺，缺乏免疫反應，是免疫缺陷動物，類圓線蟲病的發生可能沒有任何癥狀。本研究中的腫瘤移植裸鼠，可能是因為腫瘤的移植加劇了免疫功能的受損，從而激發了潛在的糞類圓線蟲自體加速傳染擴散傳播，也可能是因為移植了污染有糞類圓線蟲的腫瘤而高度感染。因此，在腫瘤移植手術前期，一定要對供體腫瘤和受體裸鼠進行糞類圓線蟲等病原體篩查檢測，以保障質量和安全。

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