細菌生物膜的基本特性研究進展

祝司霞

(攀枝花學院醫學院，四川 攀枝花 617000)

自然界中，99.9%的細菌以生物膜形式存在[1]，細菌生物膜(biofilm，BF)是細菌為適應周圍環境而形成的自我保護形式，它是與游走細胞相對應的存在形式，絕大多數細菌在進化過程中逐漸形成了精細的粘附機制，分泌基質并相互粘連形成膜狀物附著于病灶表面，從而形成BF 的復雜團體。BF 與人類的生產生活密切相關，它可以粘附在人體組織器官表面，而且對抗生素和機體免疫力的抵抗能力大大增強，通常引起諸如慢性支氣管炎、肺部感染、敗血癥、牙周病和心內膜炎等難治疾病；而且BF 還能牢固的粘附在醫用材料上（動靜脈導管，氣管插管，導尿管，人工心臟瓣膜，人工關節等），導致醫源性感染的發生和相關治療的失敗；此外，自來水管道、下水道、空調系統等與人類生活相關的設施也會污染BF 細菌，腐蝕工業管道，造成很大的經濟損失[2]。因此，對BF 的研究已經成了醫學、微生物學、環境科學當中的熱點課題，下面對BF 的基本特性做一綜述，以期能對疾病的治療和環境的治理提供一定的理論依據。

1 生物膜的成份及其功能

BF 含有多種成分，其中水份含量可高達97%，此外，還含有細菌和細菌自身產生的胞外多聚物、吸附的營養物質和代謝產物、細菌裂解產物及環境中的特殊物質或碎屑等，它們的成分是蛋白質、多糖、核酸、肽聚糖、脂和磷脂等，約占BF 的2%～15%[3]。

BF 中的水或流動或固著在膜中。BF 中可含有純種細菌，也可含有多種細菌，能分泌多種胞外物質，幫助BF 的形成。胞外多聚物，包括胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)和糖蛋白，多糖隨細菌種類不同而不同，多高度分支，牢固地凝集在一起構成BF 的支架，也可作為某些細菌的營養物，對BF 中細菌的存活非常重要。BF 中膜整合蛋白居多，具高度的親和性，能作為黏附劑。此外，還有調節蛋白，能調節某些特定基因表達，具有信號通路作用的信號分子和一些酶等功能蛋白。BF 中的代謝產物如細菌素、維生素、抗生素和噬菌體等，它們是菌體釋放的，可以抵抗BF 外的其它異種菌群，或給細菌的生存提供足夠的營養。有學者認為，BF 中的DNA 一部分是菌體死亡裂解被動釋放的，作用不大；還有一部分是某些細菌生長到一定階段表達自溶素，促進DNA 的主動分泌，這些DNA 能促進BF 的形成和穩定BF；另外，BF 中細菌易建立感受態，可攝取胞外DNA 進行轉化，導致遺傳性狀的改變[4]。

2 生物膜的結構

目前，有兩種典型的BF 結構模型：“異質鑲嵌”模型，“蘑菇或郁金香”模型。“異質鑲嵌”模型認為，胞外多糖把眾多菌體聚集成許多的小疊狀體，疊狀體再聯結成柱狀物，外圍環繞液體層。“蘑菇或郁金香”模型則認為，BF 中的細菌形成許多微菌落，膜頂比膜底寬，形似蘑菇或郁金香，微菌落之間有輸水通路，水溶液不斷的在通路中循環流動，能夠輸送營養和排出廢物等，這種結構和功能類似原始的循環系統[5]。

有學者認為，模型化的BF 從外向內依次為：生物膜主體層(bulk of biofilm)、連接層(1inking film)、調節層(conditioning film)、基質層(substratum)。它的主要特點是BF 的結構存在著廣泛的異質性，其深處和淺處的細菌體積大小和代謝活性均有顯著差異，如產生不同的毒素，原因是細菌所處的pH 值和氧化還原電位等微環境不同，導致相同的細菌其基因表達模式不同，在BF 垂直方向不同層面的細菌RNA含量、蛋白質合成和呼吸活性均不同[6]。因此，不同細菌或同一細菌不同環境形成的BF 結構差異較大，可因種類、營養、附著的表面特性和環境條件不同形成疏松、致密或厚薄不等的BF 結構。

3 生物膜的形成

細菌形成BF 是一種本能，是表面生活時的一種生長方式，任何細菌在條件合適的情況下，都能形成BF，遺傳改變可影響其形成BF的能力。BF 的形成和發展過程經歷以下5 個階段：

3.1 調節膜的形成

宿主提供BF 表面，是細菌在宿主體內形成細菌BF 的第1 步。BF的形成大多與植入體內的生物材料和自身組織病變有關。首先生物材料和自身病變組織提供BF 表面，隨后唾液、血液、尿液、胃腸道液等含有機（主要是多糖和蛋白質）或無機營養物質的體液會在幾分鐘之內覆蓋其上，這些覆蓋于表面的體液形成一個2～10nm 的蛋白吸附層，叫做調節膜(CB)，而CB 表面的蛋白、糖蛋白、糖脂等作為特異受體可選擇性地與細菌黏附[3]，最后細菌附著其上。

3.2 菌體粘附

細菌黏附是細菌對宿主BF 表面的黏附和菌體間的聚集過程。黏附對細菌BF 的形成至關重要，細菌黏附于表面可免于被流體帶到不利于其生長的環境，例如，尿道中的大腸桿菌，牢固地附著在尿道內，免于被尿液沖出體外。最初細菌通過沉積、Brown 運動、經液體流動、細菌表面和調節膜間的靜電吸引等進行可逆性的附著[7]。細菌還可以與機體組織、生物材料表面通過化學鍵發生受體和配體間特異性結合，因此黏附具有選擇性和特異性。宿主組織表面的蛋白、糖蛋白和糖脂常可作為受體，選擇性地吸附特定種類細菌表面特定的黏附素蛋白(adhesin)。

此階段細菌BF 尚未成熟，抵抗力不強，對各種抗菌藥物也相對敏感，抑菌或殺菌效果較好。

3.3 生物膜的發展

即眾多微菌落的形成過程，微小的菌落，是BF 的基本組成單位。一方面大量游動菌體進一步黏附于已固著的菌體表面，另一方面已固著菌體大量生長繁殖，同時菌體分泌胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)顯著增加，胞外多聚物（EPS）的大量表達是細菌附著后最重要的生長變化之一。這些多聚物提供了一個堅固而有黏性的骨架，相互交叉成長鏈，將細胞固定在一起，賦予生物膜以剛性與柔韌性。EPS 把細菌粘結成細菌團塊，即微菌落(microcolony)。大量微菌落使BF 加厚[8，9]。此過程中，細菌為適應自然環境而產生一些新的特性，如BF 中細菌對抗生素抗性顯著提高，給臨床治療帶來一定的困難。

3.4 生物膜的成熟

即眾多微菌落連接成大的擴散性結構的過程。當微菌落擴大到一定程度，BF 就進入了成熟階段。大量微菌落使細菌BF 加厚，細菌BF趨于成熟。

此過程細菌通過細胞間黏附素（主要是胞外多糖）自我聚集，同時需要多種遺傳因子參與，進行信號轉導調控。研究發現菌體表面存在帶有“接觸感受器”的特定“興奮區”，能對其所接觸的物質表面進行檢測、作出應答，啟動特定基因的表達[9]。另外，細菌附著于表面后，進行生長、分裂、繁殖，其他游走細胞繼續附著，最終導致該附著位點的細菌生長環境極度擁擠，有毒代謝產物積累，許多細菌營養物質缺乏，在這種競爭壓力下，細菌啟動胞間信號系統，產生胞間信號。目前學術界比較認可的是在細菌BF 的形成和成熟中有一種信息交流系統，其中密度感應系統(quorom sensing，QS)起著重要作用，QS 能根據自身所處環境或群體密度的變化來調節多種靶基因表達，如細菌密度改變或營養條件變化時，細菌表面產生和分泌某種特定信號分子，一般稱為信息激素或自身誘導素，與調控蛋白(主動誘導子)或外激素結合構成復合物，這種復合物再與胞內特定的靶基因結合，從而激活或抑制這些基因的轉錄。這種機制能有效的促使菌體檢測其自身種群的密度變化，避免細菌過度生長而造成空間和營養物質的缺乏[10]。目前已知有5類信息激素：酰基高絲氨酸內酯(acyl homoserine，AHI)、PQSs(heptylhydroxy，庚基羥基)、AL2、循環二肽(cyclic dipeptide)和寡肽(oligopeptide)[11，15]。其中高絲氨酸內酯是一種重要的生物膜內的信號傳遞分子，高絲氨酸內酯能促進BF 的三維空間結構的形成和維持，不產高絲氨酸內酯的缺陷型菌株緊緊包裹在一起的細胞，極易被十二烷基硫酸鈉所破壞。

3.5 細菌播散

在內在的調節機制或在外部沖刷力等作用下，成熟的BF 中的部分細菌能從BF 脫離，如通過外力、波狀遷移的物理運動、或者自我消解播散到其他環境，引起感染。細菌從BF 內游離出來，轉變成浮游狀態，尋求更適宜的生存環境，再黏附到合適的介質表面形成新的BF，形成游走細胞-細菌BF-游走細胞-細菌BF 的循環往復。有人研究，大腸埃希菌的BF 中，RNA 連接蛋白CsrA 是BF 分解的始動因子[12]。

4 生物膜的特點

4.1 移動性

BF 中的細菌大部分都固著于多聚物基質中，少數可自由移動，從膜中一個微菌落移動到另一個微菌落，也可脫離BF 進一步擴散，這種擴散可能是BF 對環境變化作出應答的結果[12]。如當細菌處于饑餓或其他不利條件下，細菌能分泌胞外多糖水解酶，水解胞外多糖，從BF 內游離出來，轉變成浮游狀態。

4.2 異質性

BF 深處和淺處的細菌體積大小和代謝活性均有顯著差異，表明其結構存在著廣泛的異質性[10]。BF 的形成是一個動態過程，由于BF中的細菌在不同時間和空間發展，擴大了細菌的生存環境，造成其基因表達和生理活性上的不均質性，BF 不同層面的細菌RNA 含量、呼吸活性和蛋白質合成均不同；同時遺傳學上一致的細菌由于細菌所處微環境的pH 值和氧化還原電位等不同，可誘導其表達與浮游細菌不同的基因，常導致生理狀態發生顯著變化。處于BF 深層的細菌很難獲得養分和氧氣，代謝活性很低，而淺層的細菌則相反。因此，不均質性是細菌BF 的另一個重要特性，也與細菌的抗性有關。

4.3 復雜的結構和代謝

細菌BF 具有復雜的結構和代謝方式。BF 由胞外多糖交錯成網狀結構支架，表面附著互相粘連的菌體，BF 中具有孔道，類似原始的循環系統，可以運輸營養和代謝產物。BF 一旦建成，細菌排列密集且其代謝轉換為產生胞外多聚物，因此細胞代謝活躍，但是以很低的速度分裂[13]。而且由于BF 中的營養成分、代謝產物濃度、滲透壓和氧濃度等，自外向內呈梯度下降，所以BF 外層或表層細菌生長快速，內層細菌生長緩慢。

4.4 難治性

4.4.1 抗吞噬性

包裹著細菌的黏性基質將細菌和機體免疫系統隔開，使機體的吞噬細胞和殺傷細胞及其所分泌的酶不能對細菌產生有效的殺傷，可以逃避宿主免疫作用；同時BBF 能減少細胞因子的產生或酶解細胞因子[14]。

4.4.2 耐藥性

當細菌以BF 形式存在時耐藥性明顯增強(10～1000 倍)[14]。有效濃度的抗菌藥物能迅速殺死浮游生長的細菌和BF 表面的細菌，但對BF深處的細菌卻難以有效殺滅，但當細菌從BF 上脫落下來成為浮游菌后，很快又對抗菌藥物恢復敏感。BF 的耐藥機制不同于浮游菌，原因可能是多方面的：①BF 的黏質物屏障作用導致藥物進入BF 受阻；②BF 中的細菌生長速度較浮游菌明顯緩慢，尤其是BF 深層的細菌幾乎處于休眠狀態，而抗生素對快速生長細胞更有殺傷力；③當BF 內的細菌數量過多時，細菌密度感應系統(quorom sensing，QS)會使一部分細菌從BF 表面脫離，導致感染擴散或復發，引起臨床癥狀；④BF 中基因表達改變，使BF 菌株的生物學行為也隨之改變，導致耐藥性的發生；⑤有的細菌能分泌抗生素分解酶，使之喪失抗菌效能，其中尤以β-內酰胺酶引起的耐藥性最為重要；⑥許多細菌能產生抗生素外排泵，這種泵能夠將穿過細菌外膜的抗生素及時排出細菌體外，從而避免了抗生素與細菌的接觸；⑦激活應激反應，導致細菌的生理學改變，使其在各種環境下得到保護；⑧對抗機體免疫防御體制[13-14]。

4.4.3 粘附性

細菌BF 的形成過程是細菌與材料表面接觸附著，在材料表面形成菌落，菌落生長包埋于胞外多糖基質中，有了BF 的保護，細菌就能抵抗清洗作用和消毒因子，造成清洗和消毒的失敗。大量研究證實，細菌BF 中的粘性胞外多糖與醫用材料(各種導管、人工瓣膜、起搏器、人工關節和隱型眼鏡等)污染導致醫院感染發生密切相關[15]。醫用材料在治療危重病患和慢性病患領域應用廣泛，易于附著細菌，如不能及時消除可能形成BF，成為醫院感染潛在因素。

4.5 胞間信號轉導

細菌BF 的形成需要胞間信號的相互傳遞，在BF 內，細菌之間通過細菌的產物來實現信息傳遞，信號分子對細菌定植在已形成菌落或定植在競爭十分劇烈的環境表面起著十分重要的作用[9]；信號分子可以改變BF 內的種群分布，改變相鄰細胞蛋白的表達，將某些遺傳特性(如抗藥性)傳遞給鄰近細胞。

4.6 分裂緩慢

在一個成熟的BF 內，細胞很少或以很低的速度分裂。由于深層的細菌很難獲得養分和氧氣，代謝產物難以排出而堆積，菌體較小，不進行頻繁的細胞分裂，此外BF 內細菌分裂受到周圍多糖的限制。

4.7 細菌分布的規律性

BF 內細菌分布并不是簡單雜亂無章的[8]。無論是單菌種還是多菌種組成的BF 內，細菌都不是隨機分布的，而是按各自的最適生存需求所組成。

綜上所述，細菌BF 與浮游細菌相比有許多不同的特性，且具有粘附、耐藥、抗機體免疫的特點，給臨床治療帶來很大的麻煩，所以早期發現易形成細菌BF 菌株，加強護理防止醫用材料和人體組織上細菌BF 的形成至關重要。雖然關于細菌BF 基本特性的研究已經取得了初步進展，但在BF 的組成結構、形成機制和維持機制、BF 與機體免疫關系、耐藥等方面仍有許多復雜的機制尚無定論，特別是與BF 形成調控有關的關鍵基因的克隆及表達，對BF 形成機制分子水平的研究，以及實驗室用何種方法確定BF 的存在，都有待我們進一步研究發現。

［1］李紀兵，陸春.體內生物膜研究進展[J].微生物學雜志，2012，32(5)：83-85.

［2］李云開，宋鵬，周博.再生水滴灌系統灌水器堵塞的微生物學機理及控制方法研究[J].農業工程學報，2013，29(l5)：98-100.

［3］戚韓英，汪文斌，鄭昱，等.生物膜形成機理及影響因素探究[J].微生物學通報，2013，40(4)：677-685.

［4］唐婳，劉國生，謝志雄，等.細菌生物膜的結構及形成機制研究進展[J].氨基酸和生物資源，2006，28(3)：30-33.

［5］Lenz AP，Williamson KS，Pitts B，et a1.Localized gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms[J].Appl Environ Microbiol，2008，74(14)：4463-447l.

［6］姜麗麗.生物膜污水處理系統脫氮除磷性能及微生物群落結構研究[D].邯鄲：河北工程大學，2012.

［7］Ehrlich GD，Hu FZ，Shen K，et a1.Bacterial plurality as a general mechanism driving persistence in chronic infections[J].Clin Or thop Relat Res，2005，Aug(437)：20-24.

［8］李紀兵，陸春.體內生物膜研究進展[J].微生物學雜志，2012，32(5)：83-86.

［9］戴昕，周佳恒，朱亮，等.生物聚集體中群體感應作用的研究進展[J].應用生態學報，2O14，25(4)：1206-1212.

［10］Sauer K，Camper A K，Ehrlich GD，et a1..Pseudomonas aeruginosa displays multip-le phenotypes during development as a biofilm[J].J Bacteriol，2007，184(4)：1140-1154.

［11］Nakamura S，Higashiyama Y，Izumikawa K，et a1..The roles of the quorumsensing system in the release of extracellular DNA，lipopolysaccharide，and membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa[J].Jpn J Infect Dis，2008，61(5)：375-378.

［12］聶紅，王云英.細菌生物膜形成與慢性難愈性創面相關性的研究進展[J].中國微生態學雜志，2012，24(7)：661-664.

［13］Mukherjee PK，Mohamed S，Chandra J，et al.Alcohol dehydrogenase restricts the ability of the pathogen Candida albicans to form a biofilm on catheter surfaces through an ethanol-based mechanism[J].Infect Immun，2006，74(7)：3804-3816.

［14］羅銳軍，陸春，李紀兵.生物膜耐藥機制研究進展[J].微生物學雜志，2014，34（1）：92-95.

［15］賈文祥.微生物生物膜研究的新進展[J].微生物學免疫學進展，2012，40(5)：1-8.