卵泡的生長發(fā)育及其腔前卵泡體外培養(yǎng)研究進(jìn)展

何 宇

（渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院護(hù)理系，陜西 渭南714000）

哺乳動物卵巢含有大量處于不同發(fā)育階段的卵母細(xì)胞,其中多數(shù)卵母細(xì)胞存在于無腔階段的卵泡中，但大部分卵泡在無腔階段（腔前卵泡）中閉鎖、退化，沒有得到相應(yīng)的利用,這無疑是動物遺傳和育種資源的極大浪費(fèi)。因此，腔前卵泡的開發(fā)無疑是解決這一難題的有效途徑。腔前卵泡的體外培養(yǎng)技術(shù)已取得了一定的發(fā)展，建立了多種培養(yǎng)體系,有其各自的優(yōu)缺點(diǎn),本文就動物卵泡的生長發(fā)育及其腔前卵泡的體外培養(yǎng)研究方面做一綜述。

1 卵泡生長發(fā)育的一般規(guī)律和動態(tài)模式

卵泡發(fā)育始于胎兒期。胎兒出生時卵巢中已經(jīng)存在不同早期發(fā)育階段的卵泡，動物進(jìn)入性成熟期不斷會有成批卵泡及時成長，其中一個或數(shù)個成熟和排放，同時也會不斷有卵泡凋亡。動物一旦進(jìn)入老齡期，隨著卵巢機(jī)能的退化不再有卵泡發(fā)育。卵泡形成后，部分原始卵泡脫離原始卵泡庫，開始緩慢生長。此即所謂的原始卵泡啟動募集。在原始卵泡啟動以后，卵母細(xì)胞周圍的一層原始顆粒細(xì)胞其形態(tài)由扁平狀的轉(zhuǎn)變成立方或柱狀。隨著卵泡的進(jìn)一步發(fā)育，卵母細(xì)胞增大，顆粒細(xì)胞增多并由單層成多層，在第二層顆粒細(xì)胞出現(xiàn)時，透明帶開始形成，并伴有卵泡膜細(xì)胞的形成，此時的卵泡稱為次級卵泡。次級卵泡進(jìn)一步發(fā)育成為三級卵泡。在這個時期，卵泡細(xì)胞分泌的液體進(jìn)入卵泡細(xì)胞和卵母細(xì)胞間隙，形成卵泡腔。卵泡腔內(nèi)的液體為卵泡液，隨著卵泡液分泌量的增多，卵泡腔進(jìn)一步擴(kuò)大，卵母細(xì)胞被擠到一邊，并被包圍在一團(tuán)顆粒細(xì)胞中，形成突于卵泡腔中的半島，稱為卵丘。其余的顆粒細(xì)胞則緊貼在卵泡腔周圍，形成卵泡壁層的顆粒細(xì)胞層。卵泡發(fā)育到最大體積時，卵泡壁變薄，卵泡腔內(nèi)的卵泡液體積增加到最大，稱為成熟卵泡。哺乳動物性成熟后，只有少數(shù)的原始卵泡生長發(fā)育成熟并排卵，絕大多數(shù)卵泡中途閉鎖而死亡,少數(shù)卵泡發(fā)育成熟至排卵[1]。

卵泡發(fā)育從形態(tài)上可分為幾個階段,依次為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡、格拉夫卵泡和排卵前的成熟卵泡。有的把初級卵泡開始生長以至三級卵泡階段,統(tǒng)稱為生長卵泡。有的又根據(jù)卵泡出現(xiàn)泡腔與否分為腔前卵泡(或稱無腔卵泡)和有腔卵泡(或稱囊狀卵泡)。三級卵泡以前的卵泡尚未出現(xiàn)卵泡腔統(tǒng)稱為腔前卵泡。三級卵泡開始出現(xiàn)泡腔后至成熟卵泡,稱為有腔卵泡[2]。

卵泡的生長發(fā)育是一個動態(tài)的過程，開始于募集一個或多個原始卵泡到生長卵泡庫，終止于排卵或卵泡閉鎖，呈現(xiàn)“卵泡波”的特征。卵泡波實(shí)質(zhì)上就是卵泡周期性生長發(fā)育的一種動態(tài)變化過程。首先，卵泡庫中一組卵泡被吸收發(fā)育，其中有一個或數(shù)個確立為優(yōu)勢化卵泡繼續(xù)生長發(fā)育，并明顯抑制其余卵泡的生長，最終導(dǎo)致它們閉鎖。在正常發(fā)情周期中一個卵子排出大概經(jīng)歷下列過程：吸收，選擇，優(yōu)勢化，退化或排卵[3]。

2 動物腔前卵泡體外培養(yǎng)的研究概況

動物腔前卵泡的研究開始于20世紀(jì)60年代。當(dāng)時的研究僅限于細(xì)胞分離的方法和卵巢形態(tài)學(xué)與組織學(xué)等方面的內(nèi)容。Gorb[4]等用0.5%鏈酶蛋白酶消化小鼠卵巢中的纖維組織，分離腔前卵泡，得到了初級卵泡、生長卵泡及排卵前卵泡，并研究了卵泡在體內(nèi)的生長和內(nèi)分泌的活動。隨后，Niocsia等[5]比較系統(tǒng)地建立了一套家兔各級卵泡的分離技術(shù)。20世紀(jì)80年代，Roy等[6]分離倉鼠卵巢卵泡取得成功，部分已形成腔。Lisa建立了大鼠腔前卵泡新的培養(yǎng)體系,即多聚賴氨酸鋪層體外培養(yǎng)大腔前卵泡,在體外觀察到了卵泡內(nèi)膜的形成過程和卵泡腔的形成[7]。人的腔前卵泡研究比較晚，這是由于人卵巢組織的來源十分有限，加之一些社會因素，阻礙了人腔前卵泡的研究。Roy等[8]年首次報道了人腔前卵泡的分離和培養(yǎng)。Dolmans等[9]等改用純凈的膠原酶獲得數(shù)量少但是質(zhì)量好的人腔前卵泡。目前,嚙齒類動物已從何原始卵泡培養(yǎng)到排卵、受精最終獲得了活的小鼠[10]。家畜類腔前卵泡的研究進(jìn)展也很大，取得突破性進(jìn)展的是Figueiredo等[11]建立了一套酶結(jié)合機(jī)械法成功的回收了大量牛的各級卵泡。Hirao等[12]先用酶法處理，再用機(jī)械法剝離豬卵巢卵泡，經(jīng)體外培養(yǎng)獲得成熟卵子，受精后實(shí)現(xiàn)精子穿入。Gpuat等[13]用機(jī)械方式分離水牛的小腔前卵泡，與牛卵巢間質(zhì)細(xì)胞或胎牛成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)可以存活30d。在國外，豬腔前卵泡實(shí)現(xiàn)在體外培養(yǎng)、生長發(fā)育并獲得受精的能力。國內(nèi)其卵裂率達(dá)到60%,囊胚率為22%[14]。在牛上，腔前卵泡在無血清的培養(yǎng)系統(tǒng)中可以存活28d，并形成卵泡腔，成腔率達(dá)50%[15-16]。芮榮等[17]體外培養(yǎng)山羊腔前卵泡16d，獲得了1枚孤雌激活卵。且EGF(50ng/ml)與IGF-I(100ng/ml)的聯(lián)合培養(yǎng)能夠提高山羊腔前卵泡卵母細(xì)胞的生長率和成活率[18]。

［1］謝成俠,等.家畜繁殖及其應(yīng)用[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社,1993:25.

［2］楊增明.生殖生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2005:75-83.

［3］吳延光,于元松,譚景和.哺乳動物卵泡發(fā)育模式及調(diào)控機(jī)理[J].動物學(xué)雜志,2002(37):83-87.

［4］Grob HS.Enzymatic dissection of the mammalian ovary[J].Science，1964,146:73-74.

［5］Nicosia SV，Evangelista I，Batta SK.Rabbit ovarian follicles.Isolation technique and characterization at different stages of development[J].Biol Reprod，1975,13:423-447.

［6］Roy SK，Greenwal GS.An enzymatic method for dissociation of intact follicles from the hamster ovary:histological and quatitative aspects[J].Biol Reprod，1985,32:203-215.

［7］Lisca,Shilla C,Thoma S J C.In vitro folliculogenesis of rat preantral follicles[J].Endocrinology,1995,136:3369-3371.

［8］Roy SK，Treacy BJ.Isolation and long-term culure of human preantral follicles[J].Fertil Steril,1993,59:783-790.

［9］Dolmans MM,Michaux N,Camboni A，et al.Evaluation of Liberase,a purified enzyme blend,for the isolation of human primordial and primary ovarian follicles[J].Human Reproduction,2006,12(2):413-420.

［10］Eppig J J，O’Brien M J.Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles[J].Biol ReProd，1996,54:197-207.

［11］Figueiredo J R，Hulshof S C J，Vanden Hurk R，et al.Develoment of a combined new mechanical and enzymatie method for the isolation of intact preantral follicles from fetal，calf and adult bovine ovaries[J].Theriogenology，1993,40:789-799.

［12］Hirao Y，Nagai T，Kubo M，et al.In vitro growth and maturation of pig oocytes[J].Jomal of Reproduetion and Fertility，1994，100:333-339.

［13］Gupta P S，Nandi S，Revindranatha B M,et al.In vitro culture of buffalo(Bubalus bubalis)Preantral follieles[J].Theriogenology，2002，57(7):1839-1854.

［14］Wu J,Qi T.Role of follicle stimulating hormone and epidermal growth factor in the development of porcine preant ral follicle in vitro[J].Zygote,2007,15:233-240.

［15］McCaffery F H，Leask R，Riley SC，et al.Culture of bovine preantral follicles in a serum-free system:markers for assessment of growth and development[J].Biology of Reproduction，2000，63:267-273.

［16］周虛,RobertWebb.牛腔前卵泡在體外無血清培養(yǎng)中發(fā)育為有腔卵泡[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2002,22(5):518-519.

［17］芮榮,張涌.山羊腔前卵泡卵母細(xì)胞體外發(fā)育與體外成熟的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2000,31(6):481-491.

［18］Huanmin Zhou,Yong Zhang.Regulation of in vitro growth of preantral follicles by growth factors in goats[J].Domestic Animal Endocrinology,2005,28:235-242.