豬偽狂犬病病毒的檢測(cè)方法研究進(jìn)展

顧 凡，黃 山，劉鵬娟，黃劍波，卓秀萍，朱 玲

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川 雅安；2.四川省雅安市石棉縣畜牧局，四川 雅安）

偽狂犬病(pseudorabies，PR)又稱奧葉茲基氏病，是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科中的偽狂犬病病毒(PRV或 ADV)引起的一種或多種動(dòng)物感染的急性傳染病，其中豬最易感，發(fā)病也最嚴(yán)重，是病毒的長(zhǎng)期儲(chǔ)存者和排毒者，且具有高致死率，這無(wú)疑給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報(bào)的多動(dòng)物病毒共患病，該病自1902年在美國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)曾在全球范圍內(nèi)流行。目前一些國(guó)家已經(jīng)成功根除了這一疾病，但在我國(guó)，該病在大多數(shù)養(yǎng)殖區(qū)域依然存在。為了預(yù)防、控制進(jìn)而最終根除該病，研究人員對(duì)該病進(jìn)行了廣泛的研究，在國(guó)內(nèi)外研究人員的不懈努力下，建立了若干病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等檢測(cè)方法。以下是這幾類主要方法的綜述。

1 病原學(xué)檢測(cè)方法

1.1 病理組織學(xué)檢測(cè)

成年豬主要表現(xiàn)為隱性感染，無(wú)明顯癥狀；母豬流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，仔豬表現(xiàn)發(fā)熱、昏迷、神經(jīng)癥狀、肌肉震顫，嚴(yán)重時(shí)四肢劃水樣運(yùn)動(dòng)，體溫升高達(dá)42 ℃。取樣本的腦和脊髓做組織切片，蘇木素-伊紅染色后觀察呈現(xiàn)非化膿性腦炎變化，其他部分剖檢特征不明顯。在神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可檢出A型核內(nèi)包涵體，眼觀主要見(jiàn)腎臟有針尖狀出血點(diǎn)，其他肉眼病變不明顯。

1.2 病毒分離檢測(cè)

病毒分離是采取病死豬或處于發(fā)熱期病豬的腦組織（中腦和腦橋含毒量最高）、腎及扁桃體等組織來(lái)分離病毒，經(jīng)滅菌的平衡鹽溶液或生理鹽水稀釋后接種在被培養(yǎng)成單層的細(xì)胞上，觀察至出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變。病毒分離鑒定是診斷該病的可靠方法，被認(rèn)為是診斷該病的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。研究表明，用病毒分離免疫熒光染色和核酸探針雜交的方法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室感染的一株P(guān)RV，結(jié)果顯示，病毒分離方法和核酸探針雜交方法在檢測(cè)病料上具有很好的一致性。

1.3 動(dòng)物接種試驗(yàn)檢測(cè)

取分離的病毒上清液，在家兔腹側(cè)皮下注射2 mL/只。開始時(shí)家兔精神萎靡，食欲不振，于接種后8 h和10 h左右體溫上升最終達(dá)到39.5～41.5 ℃。2～3 d后，注射局部出現(xiàn)奇癢癥狀(啃咬注射部位)，致使皮膚破損出血，隨即后肢麻痹，臥地不起，不時(shí)出現(xiàn)痙攣，維持1～2 d后抽搐死亡。雞胚接種3～4 d后，雞胚死亡。囊膜水腫、充血、出血，并有數(shù)量不等、大小不一白色痘斑樣病灶，胚體萎縮，頭蓋部突起，全身彌漫性出血。可通過(guò)此現(xiàn)象判斷為已感染偽狂犬病病毒。

1.4 病毒粒子的形態(tài)觀察

偽狂犬病病毒有皰疹病毒的一般形態(tài)特點(diǎn)，即病毒粒子呈橢圓形或圓形外觀，位于細(xì)胞核內(nèi)，無(wú)囊膜的病毒粒子直徑約為110～150 nm，位于胞漿內(nèi)帶囊膜的成熟粒子直徑為150～180 nm。囊膜表面有呈放射狀排列的纖突，長(zhǎng)度約為8～10 nm。核心致密，未成熟的病毒粒子呈中空狀。

2 血清學(xué)檢測(cè)方法

2.1 中和試驗(yàn)

血清中和試驗(yàn)技術(shù)(SNT)是檢測(cè)病毒比較經(jīng)典的血清學(xué)方法，應(yīng)用比較方便，很多國(guó)家都采用此法檢測(cè)PRV，方六榮等[3]用MSNT進(jìn)行了PRV的血清學(xué)調(diào)查。通過(guò)監(jiān)測(cè)中和指數(shù)和中和效價(jià)，發(fā)現(xiàn)MSNT的特異性很強(qiáng)，但敏感性較低。邱德新等[4]應(yīng)用血清中和實(shí)驗(yàn)(SNT)和偽狂犬病乳膠凝集實(shí)驗(yàn)(LAT)診斷試劑盒進(jìn)行了PRV抗體效價(jià)測(cè)定和相關(guān)性分析，結(jié)果表明2種方法檢測(cè)結(jié)果符合率高，特異性強(qiáng)，快速簡(jiǎn)便和實(shí)用。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是目前最為廣泛應(yīng)用的一種免疫檢測(cè)方法，是被國(guó)際貿(mào)易指定檢測(cè)PRV的方法之一[5]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其作為檢測(cè)豬PR的首選血清學(xué)方法。美國(guó)也將ELISA作為PR的3種法定檢測(cè)方法之一。它是以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固體載體上，隨后的一系列免疫學(xué)和酶促生化反應(yīng)都在此固相載體上進(jìn)行的免疫酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)適用于實(shí)驗(yàn)室大批樣品檢查，產(chǎn)地檢疫，流行病學(xué)調(diào)查和無(wú)本病健康豬群的篩選建立。

包 括 gE-ELISA，gC-ELISA，gG-ELISA ，gE-ELISA是一種靈敏度很高的ELISA，它是根據(jù)疫苗株缺失的糖蛋白構(gòu)建的一種鑒別ELISA。國(guó)內(nèi)蔣玉雯等[6](1988)建立了檢測(cè)偽狂犬病病毒抗體間接ELISA方法，認(rèn)為ELISA敏感性高，且快速、簡(jiǎn)便，適于大面積血清學(xué)調(diào)查。Oirschot等通過(guò)ELISA中和試驗(yàn)檢測(cè)感染豬血清，進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，gC-ELISA和gE-ELISA方法較為敏感；Marchioli和Cook等建立了阻斷gG-ELISA技術(shù)，該方法較常規(guī)ELISA方法敏感性低[7]。唐勇[8]在克隆表達(dá)的基礎(chǔ)上建立了gG-LAT、gG-ELISA 和 gE-LAT、gE-ELISA。結(jié)果表明，gG-LAT和gG-ELISA特異性強(qiáng)、敏感性高，目前，國(guó)際上有各種商品化ELISA試劑盒出售。汪招雄等[9]以豬偽狂犬病病毒(PRV)Ea株特異性單克隆抗體576株為捕獲抗體，純化的抗PRVIgG為檢測(cè)抗體，建立了檢測(cè)PRV抗原的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果表明，雙抗體夾心間接ELlSA方法也具有敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物組織中PRV的檢測(cè)。

2.3 乳膠凝集試驗(yàn)

乳膠凝集試驗(yàn)技術(shù)(LAT)是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將抗原先用乳膠包被，然后再與相應(yīng)血清反應(yīng)，幾分鐘內(nèi)即可得出結(jié)果。美國(guó)已經(jīng)有商品化的LAT試劑盒供臨床使用，LAT操作簡(jiǎn)單、方便、快速，且敏感性高、特異性強(qiáng)，據(jù)實(shí)驗(yàn)比較，LAT比SNT敏感、適用于疫病監(jiān)測(cè)或流行病學(xué)調(diào)查，以及種豬群檢疫凈化陽(yáng)性豬的初次篩選。另一方面，查找及消除非特異性凝集是今后努力的目標(biāo)之一。

2.4 血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)

該方法利用偽狂犬病毒能夠凝集某種動(dòng)物紅血球，HA可被抗偽狂犬病病毒的高免血清特異性抑制的原理來(lái)達(dá)到檢測(cè)偽狂犬病病毒的目的。吳平等[10]用單克隆抗體致敏綿羊紅細(xì)胞建立了反向間接血凝抑制試驗(yàn)(HI)，廖文軍[11]等以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(ScFv)-PRV gE蛋白雙功能融合蛋白為抗原，建立了檢測(cè)豬偽狂犬病病毒gE抗體的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)[12]。與美國(guó)進(jìn)口的PRV抗體檢測(cè)gE-ELISA診斷試劑盒比較，紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法具有操作簡(jiǎn)便、敏感性、特異性較高的特點(diǎn)，可用于PRV野毒感染的快速篩查。王云龍等[13]（2009)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)比試驗(yàn)及臨床樣品檢測(cè)也證實(shí)紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、特異、快速、適于基層養(yǎng)殖者使用的特點(diǎn)，在獸醫(yī)的檢測(cè)技術(shù)上具有很好的應(yīng)用前景。

2.5 免疫組化

免疫組織化學(xué)技術(shù)按照標(biāo)記物的種類可分為免疫熒光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等，利用抗原抗體特異性結(jié)合原理和組織化學(xué)方法，使其結(jié)合部位顯示出來(lái)，以達(dá)到對(duì)動(dòng)物組織或細(xì)胞中的抗原的定位、定量、定性的研究。其中運(yùn)用得較多的為免疫熒光試驗(yàn)(FA)，在1995年建立的熒光抗體染色（FA）技術(shù)可直接檢測(cè)組織培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)感染和自然感染的動(dòng)物病料中的PRV，同時(shí)做了阻斷試驗(yàn)和 TGEV、PEDV、HEV、RV、CDV、BEFV、BVDV 等交叉檢測(cè)試驗(yàn)，證明該診斷方法具有較高的特異性和敏感性。熒光抗體染色具有特異性強(qiáng)、精確性高和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，是一種快速檢測(cè)PRV的方法。另一種常用方法，膠體金免疫層析，利用PCR技術(shù)從PRV基因組中克隆gE抗原表位基因，將其插入到載體中，構(gòu)建成原核表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)其表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后作為抗原，結(jié)合膠體金標(biāo)記技術(shù)，利用雙抗原夾心法在國(guó)內(nèi)首先建立了PRV gE抗體檢測(cè)的免疫層析試紙條。此后，廖文軍等也制作出檢測(cè)PRV gE抗體的雙抗原膠體金試紙條，其特異性和敏感性與美國(guó)IDEXX和法國(guó)LSI gE-ELISA抗體檢測(cè)診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性好，適合豬偽狂犬病的臨床診斷及豬偽狂犬病野毒感染的快速篩查。

2.6 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

利用微量瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGID)檢查豬血清中PRV抗體，AGID的原理是抗原和抗體在瓊脂中自由擴(kuò)散相遇后發(fā)生肉眼可見(jiàn)的沉淀。由于AGID技術(shù)操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，特異性好，無(wú)需特殊設(shè)備，與SNT技術(shù)相比有很大的優(yōu)勢(shì)，因此適用于基層獸醫(yī)單位和大型豬場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)的定性診斷及豬群有無(wú)隱性感染的普查。

2.7 免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)(IE)是利用凝膠電泳與雙向免疫擴(kuò)散2種技術(shù)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法，建立了對(duì)流免疫電泳方法（CIE）檢測(cè)豬PRV血清抗體，研究人員又以中和試驗(yàn)做參考，對(duì)比研究了CIE和微量免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（MID）對(duì)PRV抗體檢測(cè)的效果，結(jié)果表明兩者敏感性相近，卻都不如中和試驗(yàn)敏感。但是 CIE 和 MID 方法對(duì)血清質(zhì)量要求不如VN方法嚴(yán)格。同時(shí)CIE表現(xiàn)出的快速診斷優(yōu)勢(shì)很明顯，特異性好，無(wú)交叉反應(yīng)。

3 分子生物學(xué)方法

3.1 核酸探針技術(shù)

核酸探針又稱核酸雜交，利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針即識(shí)別特異堿基序列(靶序列)的有標(biāo)記的一段單鏈DNA(或RNA)分子，與被測(cè)定的靶序列互補(bǔ)，以檢測(cè)被測(cè)靶序列的技術(shù)。郭萬(wàn)柱等[14]建立了用32P標(biāo)記PRV全基因組DNA和重組質(zhì)粒PSAGI-19 DNA作探針檢測(cè)PRV的DNA的斑點(diǎn)雜交法，2種探針均能檢測(cè)到10 pg的PRV DNA，但由于同位素標(biāo)記探針的放射性污染及危害使其應(yīng)用范圍受限。在PCR出現(xiàn)之前，原位雜交是短時(shí)間檢查 PRV 潛伏感染最敏感的方法[15]。此后，劉志杰等[16]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增gE基因片段，制備了地高辛標(biāo)記的gE基因核酸探針，特異性好，對(duì)PRV野毒的最低檢出量為4 pg，敏感性高，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，表明該核酸探針技術(shù)靈敏性得到了提高，此后，國(guó)內(nèi)學(xué)者相繼利用偽狂犬病病毒保守性強(qiáng)的gp50基因擴(kuò)增產(chǎn)物制成地高辛標(biāo)記的探針，該探針的靈敏度達(dá)到 2pg DNA。即可用于豬偽狂犬病野毒感染的臨床診斷。由于核酸探針具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)而被應(yīng)用于PRV的診斷。DNA雜交技術(shù)雖然具有很高的敏感性，然而操作步驟比較繁瑣，需要提純DNA，僅限在條件較好的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法，通過(guò)測(cè)序?qū)Ρ葋?lái)達(dá)到檢測(cè)病毒的目的。Belak等建立了檢測(cè)PRV gB 基因的PCR方法，應(yīng)用它可以從PRV感染細(xì)胞、鼻細(xì)胞、急性與慢性感染的臟器中檢測(cè)到DNA，其中檢出率最高的組織為三叉神經(jīng)節(jié)，幾乎為100%。Harding等建立了擴(kuò)增PRV gD 基因以區(qū)分來(lái)自人和其他動(dòng)物皰疹病毒的PCR方法。國(guó)內(nèi)學(xué)者又建立復(fù)合 PCR，可用于擴(kuò)增 PRV gB、gE 基因，可有效地鑒別野毒感染和疫苗接種[17]。孫德剛等[18](2007)，建立了擴(kuò)增 PRV gD基因的PCR 方法，其特異性都較之前好。期間還有實(shí)時(shí)熒光定量PCR[19-21]，針對(duì)臨床上的混合感染問(wèn)題又建立了多重PCR方法。潘群興等[22]建立了一種同時(shí)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)疫苗株與野毒株的多重PCR方法；曲光剛等[23]建立了PRV、PPV雙重PCR檢測(cè)方法，具有良好的特異性和敏感性；岳豐熊[24]建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)PCV2、PPV、PRV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)的多重PCR方法(mPCR)；國(guó)外研究人員又建立了快速檢測(cè)PRV、PPV、PCV1和PCV2的多重PCR方法[25-26]；LeeCS等[27]建立了可同時(shí)檢測(cè)豬體內(nèi)偽狂犬病病毒、細(xì)胞巨化病毒和豬圓環(huán)病毒的多重PCR方法；YueF等[28]建立了快速檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的多重PCR方法。通過(guò)不同組合可檢測(cè)出1種或多種病毒。此后國(guó)內(nèi)研究者又參照GenBank中的豬瘟病毒(CSFV)、豬流感病毒(SIV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV) 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因序列，設(shè)計(jì)了5對(duì)引物擴(kuò)增其目的片段，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了檢測(cè)CSFV、SIV 、PCV2、PRV 和 PRRSV 的 多 重PCR(mPCR)診斷方法[29]。敏感性和特異性結(jié)果顯示，該mPCR對(duì)5種病毒的最低核酸檢測(cè)量為10 pg。PCR技術(shù)檢測(cè)PRV具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便、適合應(yīng)用在PRV的臨床檢測(cè)工作中。

3.3 環(huán)介導(dǎo)的恒溫檢測(cè)方法

環(huán)介導(dǎo)的恒溫檢測(cè)方法(LAMP)是一種快速簡(jiǎn)便特異的檢測(cè)方法，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌病和病毒病的檢測(cè)。研究表明，利用該方法所建立的反應(yīng)體系在恒溫65 ℃水浴鍋中作用60 min便可得到環(huán)介導(dǎo)恒溫反應(yīng)所特有的階梯狀條帶，而豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和健康豬睪丸細(xì)胞的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，該檢測(cè)方法的敏感性是普通PCR方法的100倍。LAMP核酸檢測(cè)方法在檢測(cè)PRV早期感染方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，如果能組裝成核酸檢測(cè)試劑盒，將會(huì)是就地臨床檢測(cè)PRV野毒感染的有力檢測(cè)工具。

3.4 基因芯片

基因芯片（又稱DNA芯片、生物芯片，genechip）技術(shù)作為一項(xiàng)高新技術(shù)，在面積不大的載體上如玻片上可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種目的基因的同時(shí)檢測(cè)[30]。它是基于PCR技術(shù)和核酸雜交的原理，事先對(duì)載體表面進(jìn)行特定處理，將寡核苷酸片段或cDNA片段有序地、高密度地排列于固相載體上，形成DNA微陣列，用高精密度的激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行雜交信號(hào)的檢測(cè)[31]。將gE基因作為目的基因，并根據(jù)其基因設(shè)計(jì)引物與探針，采用不對(duì)稱PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，將探針固定在表面經(jīng)過(guò)醛基化處理過(guò)的芯片上來(lái)檢測(cè)豬偽狂犬病病毒，構(gòu)建了PRV病原檢測(cè)基因芯片，達(dá)到了對(duì)豬偽狂犬病病毒檢測(cè)的目的[32]。

4 其他方法

除以上常用的檢測(cè)方法外，還有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、放射免疫試驗(yàn)、對(duì)流免疫電泳等試驗(yàn)檢測(cè)方法。

5 討論與展望

偽狂犬病病毒屬于皰疹病毒， 一旦感染就會(huì)終身帶毒， 注射疫苗雖能減少其發(fā)病， 但是不能完全阻止其感染和排毒， 在應(yīng)激條件下( 如密度過(guò)大、混群、轉(zhuǎn)欄、分娩等)，潛伏的病毒就會(huì)被激活，反過(guò)來(lái)影響其他正常豬。故開展種豬PRV的凈化是解決感染的首要問(wèn)題。而要進(jìn)行凈化，建立能有效區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的鑒別檢測(cè)方法則相當(dāng)重要。gE抗體檢測(cè)試劑盒是一種阻斷gE-ELISA，由于目前普遍使用gE基因缺失疫苗，因此通過(guò)gE-ELISA方法可以將疫苗免疫豬和野毒感染豬區(qū)別開來(lái)，在亞臨床感染和隱性感染的診斷中具有顯著優(yōu)勢(shì)。通過(guò)gE-ELISA的血清學(xué)檢測(cè)以及基于gE基因的PCR方法對(duì)發(fā)病豬檢測(cè)是目前實(shí)驗(yàn)室診斷中廣泛使用的方法。在規(guī)模化豬場(chǎng)進(jìn)行全群采樣或抽樣后進(jìn)行g(shù)E抗體和基因的檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行隔離或淘汰處理，有計(jì)劃地進(jìn)行檢測(cè)可以顯著降低豬場(chǎng)的偽狂犬病病毒感染率，通過(guò)數(shù)次的檢測(cè)淘汰可以在某些豬場(chǎng)根除豬偽狂犬病病毒感染。因此在檢測(cè)方法中g(shù)E基因的檢測(cè)方法是將來(lái)根除豬偽狂犬病的主要方法也必將在豬偽狂犬病的凈化中發(fā)揮重要作用。

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