豬體細(xì)胞核移植的影響因素

陳 思，羅光彬，王輝田，孫 超

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

體細(xì)胞核移植是將供體細(xì)胞核移入去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制，經(jīng)過體外培養(yǎng)后，將發(fā)育良好的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)的技術(shù)[1]。近年來，體細(xì)胞克隆豬在建立人的動(dòng)物疾病模型和人類器官移植，進(jìn)行基因工程藥物生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)克隆治療等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，己成為當(dāng)今體細(xì)胞克隆研究的熱點(diǎn)。盡管豬體細(xì)胞核移植已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但移植效率依然很低，只有少量的重構(gòu)胚胎能最終發(fā)育成為克隆動(dòng)物；這是因?yàn)樵谪i的體細(xì)胞核移植過程中，實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣，影響因素較多，任何一個(gè)操作步驟和制約因素都將導(dǎo)致效率的降低或移植失敗。為了提高豬體細(xì)胞核移植效率，有必要對(duì)豬體細(xì)胞核移植過程中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行分析和優(yōu)化，對(duì)影響豬體細(xì)胞核移植的因素進(jìn)行探討研究。

1 國(guó)內(nèi)外豬體細(xì)胞克隆的研究現(xiàn)狀

1997“多莉”羊誕生，揭開了體細(xì)胞克隆的序幕，2000年，Polejaeva等得到首例體細(xì)胞克隆豬之后，Onishi和Bet-thauser等相繼分別成功地得到了體細(xì)胞克隆豬，2003年，Sanghwan等克隆出了表達(dá)強(qiáng)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因豬，Jagdeece等克隆出了敲除α-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬，從而為人類培育異種器官移植豬跨進(jìn)了一大步。在國(guó)內(nèi)，李寧教授已于2005 年成功培養(yǎng)出我國(guó)首例克隆豬[2]；竇忠英等用胚胎細(xì)胞核移植產(chǎn)生6頭豬；魏慶信等得到了胚胎細(xì)胞核移植豬；李光鵬等把豬體細(xì)胞胚胎的細(xì)胞核通過電融合移植到去核的體內(nèi)和體外成熟卵母細(xì)胞中，出生了2頭克隆豬；孫興參等獲得了豬卵丘細(xì)胞克隆囊胚；2003年馮秀亮得到了人體細(xì)胞和豬卵母細(xì)胞異種核移植囊胚[3]。盡管如此，豬的體細(xì)胞克隆效率很低，與其他動(dòng)物相比核移植難度更大，這是因?yàn)樨i的卵子體外成熟胞質(zhì)成熟不完全，發(fā)育能力不如體內(nèi)獲得的卵子；胞質(zhì)較黑，較難顯微操作；胞質(zhì)內(nèi)富含脂滴，對(duì)溫度極其敏感；至少需要四枚優(yōu)質(zhì)胚胎才能建立和維持妊娠等。許多有關(guān)環(huán)節(jié)的機(jī)制還不清楚，本文就影響豬體細(xì)胞核移植主要因素的研究進(jìn)展情況進(jìn)行了綜述。

2 供體細(xì)胞對(duì)核移植效果的影響

2.1 供體細(xì)胞的來源和種類對(duì)核移植的影響

多種組織來源的體細(xì)胞如乳房上皮細(xì)胞、各種成纖維細(xì)胞、卵丘/顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞都可以用于克隆動(dòng)物，但來源于不同組織或細(xì)胞種類的細(xì)胞的重編程能力和核移植效率明顯不同。有些種類的供核細(xì)胞雖然能夠得到克隆囊胚，但沒有獲得克隆后代；以克隆豬為例，目前只有豬的胎兒成纖維細(xì)胞和卵丘/顆粒細(xì)胞作為供體細(xì)胞成功地獲得了核移植后代。張德福等對(duì)比了成纖維細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞和顆粒細(xì)胞形成重構(gòu)胚后囊胚發(fā)育率較高。

2.2 供體細(xì)胞動(dòng)物年齡對(duì)核移植的影響

供體細(xì)胞的年齡對(duì)核移植效率存在一定的影響，多數(shù)研究表明，在核移植過程中，采用來源于胚胎和新生動(dòng)物的細(xì)胞作為供核細(xì)胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚發(fā)育率，但胎兒細(xì)胞卻更容易得到健康的新生動(dòng)物。這可能是由于胎兒細(xì)胞的分化程度較低，在重組胚中更容易啟動(dòng)重編程，而成體動(dòng)物由于年齡較大，體細(xì)胞分化程度高，積累了較多的損傷和突變，因此導(dǎo)致重組胚胎發(fā)育能力降低。但也有研究認(rèn)為，體細(xì)胞克隆胚胎的發(fā)育率與供體細(xì)胞動(dòng)物的年齡無關(guān)。張運(yùn)海研究認(rèn)為在1～10代內(nèi)不影響豬重構(gòu)胚的發(fā)育能力。采用傳代早期的細(xì)胞，這樣似乎更有利于核移胚的發(fā)育，研究表明采用6～9代的供體細(xì)胞重構(gòu)胚的發(fā)育能力較佳。Kubota研究5～15代之間重構(gòu)胚發(fā)育能力差異不顯著，Kasinathan等采用18代細(xì)胞為供核，不影響核移植重組胚的發(fā)育潛力[4]。

2.3 供核細(xì)胞的細(xì)胞周期對(duì)核移植的影響

細(xì)胞周期是指親代細(xì)胞從分裂完成開始到子代細(xì)胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的時(shí)間，由G1、S、G2和M期組成，G1期為DNA合成的準(zhǔn)備階段，此時(shí)細(xì)胞核為二倍體，S期為DNA合成期，G2期是S期向分裂期過度階段，該期細(xì)胞核為四倍體。研究認(rèn)為，供體細(xì)胞的細(xì)胞周期也是影響核移植的一個(gè)重要因素，只有供核細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的細(xì)胞周期相協(xié)調(diào)時(shí)，卵母細(xì)胞的胞質(zhì)才能有效對(duì)移入的核發(fā)生分化，并重新激活它的發(fā)育程序。

在動(dòng)物核移植研究之初，認(rèn)為供體核應(yīng)該處于G1期或G0期，因?yàn)樘嶨0和G1期的供體細(xì)胞不會(huì)因?yàn)镈NA復(fù)制而產(chǎn)生多倍體。而G2和S期的細(xì)胞因DNA已合成或復(fù)制，會(huì)導(dǎo)致克隆胚發(fā)育不正常[5]。但在隨后的研究中，賴良學(xué)等研究發(fā)現(xiàn)G2/M期的細(xì)胞能在去核MII期的豬卵母細(xì)胞中重新編程，并獲得了體細(xì)胞克隆豬。此外，其他人的研究證實(shí)，G1、G2、M期的細(xì)胞均可用于核移植[6]。目前，除S期外，處于其他任何細(xì)胞周期的細(xì)胞都能成功用于克隆[7]。盡管如此，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)仍是采用血清饑餓法和接觸抑制法獲得的GO/Gl期細(xì)胞，認(rèn)為這種細(xì)胞較其他細(xì)胞周期的細(xì)胞更有利于重編程。

3 受體細(xì)胞對(duì)核移植效果的影響

3.1 受體細(xì)胞的選擇及其影響

受體細(xì)胞所處的階段對(duì)核移植的效果有著重要影響，在哺乳動(dòng)物核移植研究中，作為受體胞質(zhì)主要有三類：去核受精卵（原核胚胎）、2-細(xì)胞胚胎及去核MⅡ期成熟卵母細(xì)胞，其中卵母細(xì)胞的應(yīng)用最為廣泛。雖然采用去核受精卵的細(xì)胞作核受體已經(jīng)得到克隆動(dòng)物，但Singer等研究證明當(dāng)用去核受精卵作核移植受體時(shí)，受體胞質(zhì)所接受的胚胎核供體發(fā)育不能超過2～3細(xì)胞階段，否則其重組胚無法正常發(fā)育。Wilmut研究認(rèn)為處于MⅡ期卵母細(xì)胞有利于胚胎的重組，這是因?yàn)榕咛ブ亟M所需要的因子存在與MⅡ卵母細(xì)胞質(zhì)中，在此時(shí)期，如轉(zhuǎn)錄因子等蛋白質(zhì)從DNA螺旋軸中脫離，允許大量重組因子結(jié)合與DNA螺旋軸上，有利于重組發(fā)生。卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)是獲取大量受體細(xì)胞的主要途徑；豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)及體外發(fā)育能力與成熟液和培養(yǎng)條件有密切的聯(lián)系，現(xiàn)在普遍用兩種基本的成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)液NCSU-23和TCM199。有人比較兩種培養(yǎng)液的成熟效果，發(fā)現(xiàn)兩者在成熟率上不存在顯著差異，但其體外重組胚的發(fā)育差異顯著。一般有2種培養(yǎng)條件。①38.5 ℃、5%的CO2、95%的空氣；② 38.5 ℃、5% 的 CO2、5% 的 O2、90%的N2，研究表明在不同氧濃度下盡管囊胚形成率沒有區(qū)別，但囊胚中的細(xì)胞數(shù)在氧濃度為5%時(shí)較多。選擇合適卵齡的成熟卵母細(xì)胞作為胞質(zhì)受體對(duì)核移植有很大的影響。一般選擇成熟培養(yǎng)40～44 h的卵母細(xì)胞。

3.2 受體細(xì)胞去核方法及其影響

受體卵母細(xì)胞的完全去核是保證核移植胚胎發(fā)育的基本條件，如果去核不完全，可導(dǎo)致重組胚染色體的非整倍體性、卵裂異常、發(fā)育受阻和胚胎早期死亡。卵母細(xì)胞快速而準(zhǔn)確的去核可避免孤雌發(fā)育，縮短體外操作時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)中的干擾因素。一般有以下幾種方法[8]，①活性熒光染料（Hoeches33342）定位法，該方法去核準(zhǔn)確，但染料和紫外線對(duì)卵母細(xì)胞有毒害作用，所以去核時(shí)間不能過長(zhǎng)；②盲吸法，該法技術(shù)要求高、耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)卵母細(xì)胞損傷嚴(yán)重、影響細(xì)胞質(zhì)空間結(jié)構(gòu)；③點(diǎn)壓法，該法對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)損傷較小，去核時(shí)不用換針，能有效提高去核效率；④化學(xué)誘導(dǎo)去核法，利用脫羰秋水仙堿的作用，使MII期卵母細(xì)胞排出第二極體，從而完成去核；⑤紡錘體探測(cè)技術(shù)，是利用Spindle-view偏振光系統(tǒng)，顯示MII期染色體所處位置，并通過顯微操作法去核，去核準(zhǔn)確。

3.3 受體細(xì)胞注核的影響

按照供體細(xì)胞移入部位的不同，注核一般分為胞質(zhì)內(nèi)注射和透明帶下注射。胞質(zhì)內(nèi)注射一般用Piezoactuation（壓電-陶瓷系統(tǒng)）微注射系統(tǒng)，直接把供體核注入胞質(zhì)內(nèi)。透明帶下注射則把整個(gè)供核細(xì)胞注射至卵周隙，并需要融合。目前也有研究者直接把整個(gè)供核細(xì)胞注入胞質(zhì)內(nèi)，不需要融合而且效果非常好，其囊胚形成率達(dá)37%[9]。這可能是：①移入的供核細(xì)胞的細(xì)胞膜會(huì)逐漸在胞質(zhì)受體中消失；②這樣做不需要進(jìn)行融合，減少了體外操作時(shí)間；③移入的胞質(zhì)成分也許對(duì)重構(gòu)胚的進(jìn)一步發(fā)育很重要；④確保了DNA 能完全進(jìn)入去核的卵母細(xì)胞，避免了獲得供體核過程中對(duì)其結(jié)構(gòu)的損壞，能更有效地支持重組胚的發(fā)育。

4 細(xì)胞融合對(duì)核移植效果的影響

當(dāng)供核細(xì)胞通過帶下注核移入除去細(xì)胞核的受體卵母細(xì)胞時(shí)，供核細(xì)胞仍然由獨(dú)自的細(xì)胞膜包圍著，只有通過細(xì)胞融合，才能使供核細(xì)胞與受體卵母細(xì)胞形成卵核復(fù)合體，也就是成為一個(gè)完整細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。目前許多研究都是應(yīng)用電融合技術(shù)進(jìn)行融合，電融合是通過在短時(shí)間強(qiáng)電場(chǎng)的作用下，使細(xì)胞的雙層膜產(chǎn)生可逆性擊穿，當(dāng)這種擊穿發(fā)生在相鄰的細(xì)胞膜接觸區(qū)域時(shí)，兩側(cè)的細(xì)胞膜瞬間接觸并融合。由于該方法重復(fù)性好、細(xì)胞毒性小、融合效果好，后來逐步被廣大研究人員采納，將電融合應(yīng)用于胚胎細(xì)胞的融合，成為主要的融合方式。目前已有綿羊、牛、山羊、豬等動(dòng)物采用電融合法獲得了克隆動(dòng)物[10]。對(duì)融合效率有直接影響的因素包括電脈沖強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和脈沖次數(shù)等，電脈沖強(qiáng)度影響孔的數(shù)目和大小，持續(xù)時(shí)間影響微孔的存在時(shí)間[11]。另外，在施加直流脈沖前施加交流電，可以使細(xì)胞產(chǎn)生極化，促使細(xì)胞膜緊密接觸并使接觸面垂直于電極，從而提高融合效率。

5 激活對(duì)核移植效果的影響

在核移植過程中，因缺乏自然受精過程中的激活，需要使用物理或化學(xué)刺激，使卵母細(xì)胞激活后繼續(xù)發(fā)育。Ca2+信號(hào)途徑下游通路可導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活，所以，創(chuàng)造一個(gè)短暫的Ca2+波動(dòng)是激活過程的關(guān)鍵，但這個(gè)過程往往難以完全復(fù)制自然受精過程中Ca2+波動(dòng)。Ozi和Hunean的研究認(rèn)為[12]，Ca2+波動(dòng)的幅度、數(shù)量、頻度對(duì)早期胚胎的分裂影響不大，但Ca2+波動(dòng)與胚胎發(fā)育的效率和質(zhì)量有密切關(guān)系。目前主要有3種激活方案：①融合前激活，②融合同時(shí)激活，③融合后激活。激活后的卵母細(xì)胞，MPF活性降低，不會(huì)使移入其中的細(xì)胞發(fā)生PCC，阻止了G2期供體染色體的再?gòu)?fù)制現(xiàn)象，而Gl期和S期供體核仍可繼續(xù)進(jìn)行正常DNA復(fù)制，因而處于Gl，S，G2期的供核細(xì)胞仍繼續(xù)原來的周期進(jìn)程，保持正常核型。體細(xì)胞核移入去核的未激活的MII期卵母細(xì)胞后，在卵胞質(zhì)中高活性MPF作用下，發(fā)生核膜破裂和染色體凝集。染色體的凝集將加速核與胞質(zhì)中與核重編程相關(guān)蛋白因子的交換，促進(jìn)基因組重編程的進(jìn)行。染色體凝集也會(huì)對(duì)處于不同細(xì)胞周期的供體核倍性產(chǎn)生影響。處于Gl/GO期的細(xì)胞，因?yàn)镈NA尚未復(fù)制，其核為二倍體，當(dāng)染色質(zhì)凝集后仍為二倍體，重構(gòu)胚可以正常發(fā)育。G2期細(xì)胞作核供體時(shí)，由于DNA已復(fù)制，染色質(zhì)凝集形成4倍體，必須使一半染色體以極體形式排出才能維持染色體的正常倍性，否則重構(gòu)胚將維持異倍性而不能正常發(fā)育。而處于S期的供體核其DNA正處于復(fù)制過程中，此時(shí)發(fā)生PCC將使染色質(zhì)形成“粉末狀”形態(tài)，造成DNA嚴(yán)重?fù)p傷，重構(gòu)胚不能正常發(fā)育[13]。

電脈沖和化學(xué)物質(zhì)對(duì)能激活卵母細(xì)胞，但激活的同時(shí)不可避免地造成卵母細(xì)胞的損傷。因此，摸索出激活效率高，對(duì)卵母細(xì)胞損傷小的激活方法對(duì)胚胎的發(fā)育至關(guān)重要。

6 胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植對(duì)核移植效果的影響

胚胎的體外培養(yǎng)已有30多年的發(fā)展歷史，體外培養(yǎng)技術(shù)作為基礎(chǔ)技術(shù)廣泛地用于胚胎工程各個(gè)方面，但胚胎體外培養(yǎng)的效率還不高，并且體外生產(chǎn)的胚胎染色體倍型的異常率較體內(nèi)胚高出許多，rRNA基因的活性也明顯不同，研究表明體外培養(yǎng)系統(tǒng)的缺陷也是導(dǎo)致胚胎吸收、死亡、流產(chǎn)、死胎或出生后死亡的一個(gè)重要方面，這說明現(xiàn)有各種培養(yǎng)系統(tǒng)還無法完全模仿體內(nèi)環(huán)境，以適應(yīng)早期早期胚胎分化發(fā)育的需求。這也就需要人們對(duì)早期胚胎的發(fā)育機(jī)制作更深地探索，在改善培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，不只是單純的通過添加或去除某種成分或改變某種物質(zhì)的濃度來實(shí)現(xiàn)，而要從細(xì)胞代謝生理角度上摸索體外胚胎在早期發(fā)育過程中的實(shí)際需要，從而進(jìn)一步了解早期胚胎的發(fā)育機(jī)制，進(jìn)而提高體外生產(chǎn)胚胎的質(zhì)量。

選擇合適的培養(yǎng)液和培養(yǎng)條件對(duì)重構(gòu)胚胎的發(fā)育至關(guān)重要，為了減少體外培養(yǎng)環(huán)境對(duì)胚胎發(fā)育的不利影響，豬體細(xì)胞重構(gòu)胚胎要盡可能早地移植入雌性體內(nèi)。克隆胚胎的移植方法和胚胎移植方法相同，關(guān)鍵是要保證移入胚胎的時(shí)期和受體母畜的生理周期一致。

7 存在的問題

盡管體細(xì)胞克隆豬研究已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)化等方面取得很大的進(jìn)展。但該技術(shù)目前還很不完善，相關(guān)理論研究還很薄弱，還存在許多問題，比如核移植的效率很低、存活率低、核移植動(dòng)物的異常發(fā)育、端粒長(zhǎng)度縮短等問題，人們要提高動(dòng)物克隆的成功率需不懈的努力。這些問題的解決，將有助于加深人們對(duì)動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程中分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。因此，今后研究應(yīng)該著重于有關(guān)核重新編程分子機(jī)制的研究以及胞質(zhì)線粒體的影響等。

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