蛋白質(zhì)組學(xué)核心技術(shù)研究綜述

張鳳

（萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 萊蕪271100）

2003年4月14日，人類基因組測序完成，生命科學(xué)研究的重心轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)組（基因組的表達(dá)產(chǎn)物）上來，這標(biāo)志著后基因組時代的到來。因為蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象復(fù)雜性和多變性的直接體現(xiàn)者，是基因功能活動的執(zhí)行者，利用蛋白質(zhì)組的研究有望找到“孤兒”基因的生物功能線索，進(jìn)而揭示它在整個功能網(wǎng)絡(luò)的地位，從而了解生命現(xiàn)象和生命本質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)將會在揭示生命奧秘過程中起到極其重要的作用[1]837[2]1973。

一、蛋白質(zhì)組學(xué)

澳大利亞的MarcWilkins等人在1994年首先提出一個與基因組相對應(yīng)的整體的概念-蛋白質(zhì)組，它指的是一種基因組轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾的全套蛋白質(zhì)[3]20。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究細(xì)胞內(nèi)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)在特定時空下的動態(tài)變化，分析細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)模式以及各組分之間的關(guān)系，理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一，進(jìn)而調(diào)控生物體的生命活動，揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)[4]648[5]1152。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)核心技術(shù)

雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)、質(zhì)譜技術(shù)（MS）和生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三大核心實驗技術(shù)。

1、2-DE

1975年，意大利化學(xué)家O’Farrel在研究大腸桿、幾尼豬和鼠的蛋白質(zhì)時發(fā)明了雙向電泳技術(shù)（ISO-DLAT）[6]4008。目前，2-DE是進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的最關(guān)鍵、最成熟、最常用的技術(shù)。其原理是：根據(jù)蛋白質(zhì)等電點（pI）不同，在pH梯度膠上進(jìn)行等電聚焦(IEF)的第一向分離；根據(jù)分子量大小，在SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)中進(jìn)行第二向分離。

蛋白質(zhì)分離后可通過不同的方法染色顯示，傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)染色法易操作，重復(fù)性好，但靈敏度低。銀染法可提高兩個數(shù)量級，但顯色的淺性范圍較窄、重復(fù)性差。Berggren[7]2509等人研究發(fā)現(xiàn)熒光染色靈敏度與銀染相似，但速度更快、線性范圍更寬，同時減少了對質(zhì)譜鑒定的影響。

2-DE可在二維水平上分離10-150KD分子量的蛋白質(zhì)，是目前唯一能溶解大量蛋白質(zhì)并能進(jìn)行定量的一種方法，操作簡便，分辨率、靈敏度高，重復(fù)性較好，可用計算機(jī)進(jìn)行分離后圖像的分析處理，能提供不同基因表達(dá)與調(diào)控的特點。Agrawal等用2-DE等法，首次對臭氧對水稻幼苗蛋白的影響進(jìn)行了檢測[8]947-959。王經(jīng)源等定量比較了汕優(yōu)63及其雙親苗期的第三葉蛋白質(zhì)組，得到1667個以上的蛋白質(zhì)點，在3個品系間發(fā)現(xiàn)23個顯著差異的蛋白質(zhì)點[9]33-53。但2-DE也有其局限性：低拷貝數(shù)(<1000)、疏水性（如膜蛋白）、高分子量(>200kD)和低分子量(<8kD)蛋白無法檢測；極酸和極堿性蛋白(pH<3或pH>10)易在電泳中發(fā)生漂移；對試劑質(zhì)量要求高；樣品復(fù)雜程度高時，靈敏度和分辨率較低；自動化程度低[10]3670[11]247。Unlu等[12]2071-2077對2-DE進(jìn)行了改進(jìn)，提出了差異凝膠電泳(DIGE)。蛋白質(zhì)分離前，將熒光素標(biāo)記后的多種蛋白樣品等量混合，在同一塊凝膠內(nèi)電泳，分離后進(jìn)行質(zhì)譜分析。此法可對蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行精確、可重復(fù)的定量分析，用此法也可分析正常組織和病理（癌變或植物受外界脅迫等）條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。與常規(guī)的2-DE相比，工作量小，操作更簡便，效率、靈敏度更高，差異分析更準(zhǔn)確，結(jié)果更可信。

近年來，隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜法(Liquid Chromatography，LC)成為非凝膠蛋白分離技術(shù)中最常用的方法。為彌補(bǔ)單一液相分離的不足，現(xiàn)在一般優(yōu)化組合兩種或兩種以上不同原理的液相色譜，常見的有二維液相色譜（2D-LC）、二維毛細(xì)管電泳（2D-CE）等。色譜技術(shù)除了直接對蛋白分離分析外，常與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用。Nielsen等應(yīng)用LC—MS—MS技術(shù)成功分離和鑒定了海馬組織中的1685種蛋白質(zhì)[13]405。目前一種最新的色譜分離技術(shù)-毛細(xì)管電泳(CE)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的高效分離分析。CE分析樣品量少、成本低、速度快、靈敏度高、分離范圍大，2-DE無法分離的可用CE實現(xiàn)，并自動在線分析，但對于復(fù)雜樣品的分離尚不完全[14]89。

2、質(zhì)譜技術(shù)（MS）

MS是鑒定2-DE分離后的蛋白質(zhì)的基本手段，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的支撐技術(shù)之一，是最為重要的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)突破[15]841。其基本原理是：樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m／z)的差異來分離并確定其Mr[16]636。目前最常用的有兩種：電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDIMS)。前者是噴射過程中，液相樣品分子在強(qiáng)電場的作用下，高電壓將其離子化后進(jìn)入質(zhì)量分析器，根據(jù)m／z差異進(jìn)行分離，確定其分子質(zhì)量。目前此技術(shù)已應(yīng)用到很多串聯(lián)質(zhì)譜中，如四級桿一飛行時間(Q-TOF)質(zhì)譜、離子肼（ion-trap）質(zhì)譜等，靈敏度達(dá)fmol(10-15)。后者是讓激光照射離子化的樣品在加速電場中飛行，檢測不同的離子飛行時間（TOF）來確請定m／z（TOF和m／z的平方根成正比），得到一系列酶解肽段的分子量或部分肽序列，然后檢索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫來快速鑒定蛋白質(zhì)[14]89。目前，在鑒定蛋白質(zhì)譜中應(yīng)用最廣泛的是在MALDIMS基礎(chǔ)上改進(jìn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)，此技術(shù)可提高鑒定的準(zhǔn)確性和特異性，但對低分子量蛋白質(zhì)的鑒定效果不好[17]15。后來在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了改進(jìn)，形成了表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS），此法可直接檢測粗提樣品，且用量少（最少0.5-5ul），靈敏度高，能檢測出低豐度、小分子量的蛋白質(zhì)，可快速檢測多個標(biāo)記物，可測定膜蛋白等疏水蛋白。

這兩種技術(shù)均能在fmol(10-15)的水平上準(zhǔn)確分析高達(dá)幾十萬Mr的生物大分子，具有高通量、高靈敏度和高質(zhì)量的檢測范圍等特點[18]1479。但MS也有其自身的局限，如儀器較昂貴，不能區(qū)別氨基酸的同分異構(gòu)體如Leu和Ile、Lys和Gln，無法對某些多肽的固有序列進(jìn)行測定，不能將帶電電荷和分子量相同的同分異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分。在應(yīng)用中，MALDI—MS常和2D凝膠電泳聯(lián)用，ESI-MS常和LC聯(lián)用[19]1519-1520。如盧定強(qiáng)等利用LC-ESI-MS法對銀杏葉進(jìn)行了初步研究，得到了ESI-MS質(zhì)譜圖，分析鑒別出白果內(nèi)酯及銀杏內(nèi)酯A、B、C、J[20]9211。

3、生物信息學(xué)

它是伴隨著人類基因組計劃的啟動和信息科學(xué)的迅猛發(fā)展而興起的、以生物、數(shù)學(xué)、計算機(jī)等多學(xué)科為理論基礎(chǔ)形成的一門新的交叉性學(xué)科。研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，運用數(shù)學(xué)、計算機(jī)科學(xué)手段收集、存儲、加工、分析并解釋大量原始生物試驗數(shù)據(jù)，獲得具有生物學(xué)意義的生物信息，通過查詢、搜索、比較、分析相關(guān)生物信息，獲取基因編碼、調(diào)控、蛋白質(zhì)和核酸結(jié)構(gòu)功能及相互關(guān)系等信息，尋找蛋白質(zhì)家族保守序列，預(yù)測蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要支撐技術(shù)[21]6142，它的發(fā)展將給生命科學(xué)的研究帶來重大變革。

目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的應(yīng)用主要有：構(gòu)建與分析2-DE圖譜。建立和搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫（SMSS-PROT、BLOCKS、SMART等），其中日內(nèi)瓦大學(xué)建立的EXPASY服務(wù)器是最著名的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，SWISS-PROT是目前世界最大、種類最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，開發(fā)與應(yīng)用各種分析及檢索軟件，通過網(wǎng)絡(luò)檢索功能蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE圖譜對應(yīng)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，來識別蛋白質(zhì)、描述其理化性質(zhì)、預(yù)測可能的翻譯后調(diào)節(jié)方式及三維結(jié)構(gòu)與功能等，這些都極大地提高了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究效率[14]90[22]591。

三、展望

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)三大核心實驗技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)在揭示生長、發(fā)育和代謝調(diào)控等生命活動的規(guī)律研究中取得了重大的突破，已廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中。醫(yī)學(xué)上，可比較正常與疾病細(xì)胞中的蛋白質(zhì)電泳圖譜，分離鑒定其各自的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)蛋白—分子標(biāo)記物，從而進(jìn)行疾病的診斷。也可以對致病菌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析研究，驗證已有的藥物靶點，闡明藥物作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)新的作用位點和受體，為藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。在生物基礎(chǔ)研究上也涉及多種生物學(xué)現(xiàn)象，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞分化等。我們相信，隨著新的研究技術(shù)的不斷突破，分離鑒定的低豐度蛋白及新蛋白會越來越多，更多的生物學(xué)現(xiàn)象將會被揭示，更多的疾病相關(guān)蛋白將會被分離鑒定出來，蛋白質(zhì)組學(xué)必將逐漸揭示生命的奧秘，推動人類的健康事業(yè)，給人類生活帶來重大影響。

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