祁門紅茶多酚提取物對CCl4誘導的小鼠肝損傷保護作用的研究

崔燕芒，李 鵬，陳錦文，趙 燕*(.第四軍醫大學藥學院，西安 7002；2.解放軍第56醫院藥劑科，西寧 80007；.青島市海慈醫療集團急診科，青島 2660)

茶葉已有幾千年的栽培和飲用歷史，喝茶有助于身體健康，對一些疾病具有預防作用也被實驗所證實[1]。茶葉中的茶多酚是一種天然的抗氧化劑，也是一種理想的天然藥物，具有清除自由基和抗氧化等生物活性， 其抗氧化活性高于一般的非酚性或單酚羥基類抗氧劑[2]。侯冬巖等研究顯示，茶多酚的抗氧化作用明顯優于維生素E[3]， 茶多酚通過阻斷脂質過氧化過程， 從而提高人體內各種酶的活性，起到抗突變、抗癌癥的功效。據相關實驗證實，茶葉中的茶多酚(主要是兒茶素類化合物)，對腸癌、胃癌等多種癌癥的預防和輔助治療均有益處[4-5]。肝臟是人體的一個重要器官，在代謝和解毒各種內源性和外源性有害物質中扮演了一個關鍵的角色[6]。近年來飲食、飲酒所致的肝病人數在逐漸增加， 嚴重者可以發展為肝炎、肝硬化。肝臟損傷是由于脂質過氧化反應引起的肝細胞損傷[7]。文獻報道，從茶葉中提取的多酚對肝損傷和肝纖維化具有保護作用， 但關于祁門紅茶對急性肝損傷保護作用的研究尚未見報道。祁門紅茶(Keemun black tea)產于中國安徽省祁門縣，以“香高、味醇、形美、色艷”四絕馳名于世。據史料記載，祁門紅茶始制于清代光緒年間，為工夫紅茶的珍品。祁門紅茶中特有的香味，被國外不少消費者稱之為“祁門香”，在國際市場上被稱之為“高檔紅茶”，現在飲茶已被認為是中國的一種傳統文化[8]。本實驗旨在從祁門紅茶中提取茶多酚，進行體內抗氧化實驗研究，探究祁門紅茶的肝保護機制、藥理作用機制，為其開發應用提供依據。

1 儀器與材料

1.1儀器 XP205型電子分析天平(梅特勒-托列多國際股份有限公司)；KQ5200DE超聲波清洗機(昆山超聲儀器有限公司)；H-1型渦旋混勻儀(上海康禾北電儀器有限公司)；TG20型高速離心機(長沙英泰儀器有限公司)；UV752型紫外分光光度計(京華儀器責任有限公司)；SHT-88型恒溫水浴鍋(浙江太倉實驗設備廠)；Tensor 27紅外光譜儀(德國布魯克儀器有限公司)；MILLI-Q Academic A10超純水儀(美國密里博公司)；DMIL LED型倒置熒光顯微成像系統(徠卡微系統股份公司)；KD2508型輪轉切片機(浙江金華科迪儀器設備有限公司)。

1.2試藥 祁門紅茶從茶葉市場購買，從茶葉的形狀、色澤、香氣、滋味、湯色等方面來鑒別為優質紅茶；沒食子酸、乙酸乙酯、甲醇、四氯化碳(Sigma-Aldrich有限公司，分析純)；聯苯雙酯(BP，浙江萬邦藥業股份有限公司，批號：120506)。谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉氨酶(AST)試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、 谷胱甘肽(GSH-Px)試劑盒、超氧化物岐化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3實驗動物 健康的昆明小鼠，60只，雄性，4周齡(18～22 g)，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。

2 方法

2.1祁門紅茶中茶多酚的提取 稱取祁門紅茶200 g，55 ℃微波干燥3 h，粉碎機粉碎(過600 μm篩)，加入體積分數75%甲醇作為提取溶劑(1∶10)，在80 ℃回流提取3 h，倒出上層液，殘渣再提取3次，合并提取液，轉入離心機在3 000 r·min-1轉速下離心10 min，將上清液轉移至量瓶，隨后用旋轉蒸發儀濃縮至5%，再用乙酸乙酯1∶3萃取3次，在減壓條件下，用旋轉蒸發儀除去乙酸乙酯，倒入鐵盤中，置于-20 ℃冰箱中冷凍，凍好后將鐵盤置于冷凍干燥機中使其干燥得到KBTP，經計算產率為19.5%。

2.2測定總茶多酚含量

2.2.1Folin-Ciocalteu 比色法原理 在堿性條件下，Folin-Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸可以將多酚化合物定量氧化，而自身被還原生成藍色化合物，顏色的深淺和多酚的含量成正相關。

2.2.2供試品溶液的制備 取祁門紅茶多酚粗粉約600 mg，精密稱定，平行操作3份，置于100 mL量瓶中，加入體積分數60%乙醇定容至刻度，即得。

2.2.3對照品溶液的制備 準確稱取0.300 g(精確至0.000 1 g)沒食子酸(GAE，相對分子質量188.14)用體積分數60%乙醇定容于100 mL量瓶中，配制成沒食子酸標準儲備溶液(3 mg·mL-1)。

2.2.4標準曲線的繪制 分別精密量取0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL對照品溶液,置于6個50 mL量瓶中，各加20 mL蒸餾水， 分別加入5 mL 0.2 mol·L-1FC試劑，然后加入6 mL 100 g·L-1碳酸鈉溶液，加水至50 mL， 振搖，避光反應2 h后，以蒸餾水為空白，于760 nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標、沒食子酸質量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，計算試樣中的總多酚含量[9]。

2.2.5Folin-Ciocalteu 比色法方法學評價 (1)重復性實驗 稱取祁門紅茶多酚600 mg，精密稱定(平行 6 份)，按照以上供試品溶液制備和顯色后測定，按標準曲線法測得祁門紅茶中茶多酚含量，計算相對標準偏差(RSD)，以評價該方法的重復性。

(2)加樣回收實驗 向已知總多酚含量的祁門紅茶多酚提取物待測樣品中分別加入一定量的沒食子酸標準溶液，測定并計算總多酚的回收率及相對標準偏差(RSD)，以評價該方法的準確性和可靠性。

2.2.6樣品中總酚含量的測定 分別精密吸取3份上述樣品溶液0.4 mL，按2.2.4項下操作方法測定吸光度，并根據回歸方程計算總多酚的含量。

2.3CCl4誘導小鼠急性肝損傷保護實驗

2.3.1實驗分組及處理 在室溫(22± 2 ℃)、日照08:00至20:00、相對濕度55%±5%的環境中，喂養15 d后進行實驗，本實驗過程遵循中華人民共和國科學技術委員會對動物的飼喂以及相關實驗操作要求。小鼠隨機分為6組，每組10只，依次為空白對照組(Normal)、模型組(Model)、陽性組(BP)、祁門紅茶多酚低劑量組(KBTP低)、祁門紅茶多酚中劑量組(KBTP中)、祁門紅茶多酚高劑量組(KBTP高)。

實驗持續21 d，給藥時間為每天 9：00灌胃1次。所有小鼠均可自由飲水，并飼喂標準飼料。末次給藥后，小鼠禁食6 h， 將配制好0.083 mol·L-1的CCl4(CCl4/花生油)按照0.01 mL·g-1的劑量進行腹腔注射，建立小鼠急性肝損傷模型。腹腔注射后12 h內禁食，但可自由飲水。

2.3.2準備小鼠血清及肝組織樣本 到規定時間，小鼠稱質量后從小鼠眼靜脈叢取血，之后將其斷頸處死。將血液在3 000 r·min-1的條件下離心10 min，置于4 ℃冰箱中保存，用以檢測血清中ALT、AST及ALP的含量(U·L-1)。同時立即剖取肝臟并稱量肝質量，計算肝臟指數= 肝臟濕質量(g )/ 體質量(10 g-1)。用預冷的生理鹽水沖洗肝臟表面數次，剪取肝臟右葉部分(5 mm × 5 mm × 3 mm)固定于體積分數10% (甲醛/水)福爾馬林溶液中，石蠟包埋，用于制備病理切片進行蘇木素-伊紅(HE)染色分析(用光學顯微鏡觀察其形態學改變)。 剩余肝臟剪取0.5 g放入冷的生理鹽水中，使用勻漿機2 000 r·min-1勻漿10 min，制備10%(肝組織/生理鹽水)的肝組織勻漿，置于4 ℃ 冰箱中保存，用于檢測肝組織中MDA (nmol·mg-1)，GSH-Px (mg·g-1)以及SOD (U·mg-1)的含量，所有生化指標的檢測均按試劑盒的要求進行測試。

3 結果與分析

3.1祁門紅茶多酚中總酚含量

3.1.2Foling-Ciocalteu法方法學評價 重復性實驗 祁門紅茶多酚提取物按照2.2.2項下方法制備供試品溶液和2.2.4項下方法顯色后測定，按標準曲線法計算祁門紅茶中茶多酚含量，RSD為2.5%，說明本方法重復性較好。

加樣回收率實驗 稱取不同質量的祁門紅茶多酚提取物，置于100 mL錐形瓶中，分別加入一定量的沒食子酸對照品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液后，再按2.2.4項下方法進行樣品處理、測定、計算結果。見表1。茶多酚平均回收率為99.32%，RSD為1.82%，說明本方法結果準確可靠。

表1 總茶多酚的加樣回收率實驗結果

3.2祁門紅茶多酚對小鼠體質量、肝質量影響及肝指數(HI)的影響 結果見表2。結果表明，模型組相比較正常組，體質量、肝質量及肝指數均有明顯的增加(P<0.05)。當給藥量增加至800 mg·kg-1時，小鼠的肝質量及肝指數與陽性組小鼠指標存在顯著性差異(P<0.05)。

表2 祁門紅茶多酚對小鼠的體質量、肝質量及肝指數的影響

3.3祁門紅茶多酚對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠的影響 詳見表3。由表3 可知，各組小鼠預先經過KBTP灌胃給藥400和800 mg·kg-1，然后腹腔注射CCl4，小鼠血清中ALT，AST及ALP含量明顯下降，肝組織中MDA含量降低，GSH-Px及SOD含量明顯升高，與CCl4模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明：祁門紅茶多酚具有肝保護作用，且具有一定的劑量依賴關系。

表3 祁門紅茶多酚對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠血清中ALT，AST及ALP活性和肝組織中MDA，GSH-Px及SOD含量的影響

3.4祁門紅茶多酚對CCl4誘導的急性肝損傷小鼠肝組織結構的影響 如圖1，病理學觀察顯示：正常組(A)小鼠肝臟呈現暗紅色，質地柔軟且富有彈性，光澤度良好，肝小葉結構完整。病理切片顯示：肝細胞形態規則、完整，細胞核圓潤；與之形成鮮明對比的是模型組(B)小鼠肝臟顏色灰白，質地、彈性較差，且有多個乳白色斑點，肝小葉失去正常結構，病理切片顯示肝細胞排列分散、無序，細胞形態發生明顯的變化，細胞質較少，細胞核固縮。通過觀察表明，提前給予不同劑量的祁門紅茶多酚，使肝臟均受到一定程度的保護，異常肝細胞的數量明顯減少；E與F病理切片顯示，預先經過高劑量祁門紅茶多酚和聯苯雙酯滴丸陽性藥物的分別保護，小鼠肝細胞排列規則，形態基本正常，病變細胞數目很少，結構與正常組無明顯區別，表明祁門紅茶多酚對CCl4誘導的急性肝損傷具有較好的保護作用。

圖1 肝臟的病理組織學切片(HE染色，×400)

4 討論

茶多酚具有清除自由基的生物活性功能，是基于其酚羥基作為H供體，能與自由基結合成共軛穩定的中間體產生清除及阻斷自由基的鏈式反應[10]。作為一個引發肝損傷的試劑， CCl4早已被認同。在肝藥酶P450的作用下，CCl4可轉化為·CCl3，而·CCl3本身就是一種自由基，能夠直接殺傷肝細胞。且它還能引發細胞發生脂質過氧化反應，從而破壞細胞膜的結構，最終導致細胞死亡[11]。ALT和AST含量的升高是衡量肝臟損傷最為直接、準確的指標，在本實驗中，注射四氯化碳后，模型組小鼠ALT及AST的含量迅速升高(P<0.05)，表明肝臟受到損傷，通過預先給予祁門紅茶多酚保護，小鼠血清中ALT及AST的含量有明顯的下降，血清中ALP水平亦是如此，這表明祁門紅茶多酚能夠有效抑制肝臟的脂質過氧化反應。肝組織中MDA、GSH-Px及SOD相應含量的變化表明，祁門紅茶多酚不僅能夠抑制脂質過氧化反應，還能保護線粒體膜。肝臟病理組織切片觀察發現：預先給予祁門紅茶多酚的小鼠肝細胞形態良好，無明顯畸變，這表明祁門紅茶多酚對CCl4誘導的肝臟損傷具有明顯的保護作用。這一系列的結果表明，對祁門紅茶作為藥物進行開發利用具有廣闊的應用前景。

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