毛細管電泳-光纖光譜聯用技術檢測結晶紫

韓 韻，魏國芬，張 霞，連盼盼，王金麗，呂鑒泉

(湖北師范學院 污染物分析與資源化技術湖北省重點實驗室， 湖北 黃石 435002)

毛細管電泳-光纖光譜聯用技術檢測結晶紫

韓 韻，魏國芬，張 霞，連盼盼，王金麗，呂鑒泉

(湖北師范學院 污染物分析與資源化技術湖北省重點實驗室， 湖北 黃石 435002)

開發新型毛細管電泳-光纖光譜聯用技術并應用于結晶紫的快速檢測。以結晶紫為對象，考察了電泳和溶液條件對結晶紫的分離分析信號的影響。結果表明，檢測結晶紫的最佳條件為：流動相是0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 4.0)，檢測波長590 nm，分離電壓3 kV，進樣時間60 s.在最佳條件下，吸光度與0.8～10 μg/mL結晶紫呈現良好的線性關系，相關系數為0.9954，檢出限為0.8 μg/mL.方法成功地應用于水體中結晶紫的快速檢測。

檢測;結晶紫;毛細管電泳;光纖光譜

毛細管電泳(CE)是一種新型高效分離技術，以其柱效高、分析速度快、選擇性高、試樣消耗少等優點，現已被廣泛用于醫藥衛生、生化、環境等領域[1]。近年來，毛細管電泳與多種檢測器聯用使得其應用范圍更加寬廣。Smith等將CE與改進電噴霧口連接，實現了CE-MS聯用[2～5]，Cheng等將激光熒光檢測器與CE聯用[6]，電化學檢測器的聯用使得單個神經細胞內液樣品分析成為可能[7]。Morris發展了激光拉曼光譜檢測法[8]，Huang等將電導檢測器與CE聯用，用于堿金屬離子等樣品的檢測[9]。Kuhr等利用間接熒光法與CE聯用，用于多種天然氨基酸的分離檢測[10]。

光纖光譜儀是近年發展起來的一種新型光譜儀，其光譜響應范圍寬，響應時間短，信噪比高，具有優秀的光學分辨率，高度集成化、模塊化可自由搭配，實現了一機多模檢測[11]，具有廣闊的應用前景。加州大學伯克利分校Benhabib課題組利用多通道毛細管電泳為分離設備與光纖光譜儀的熒光檢測模式聯用證實了火星中有機物大分子和生物標記物的存在[12]。亞利桑那大學Hayes等在聯用基礎上利用紫外檢測器開發出電泳排阻法，成功用于部分堿性染料的分離富集，隨后將其應用于帶異種電荷蛋白質的同時分離富集[13～15]。該方法主要建立在物理學角度，重現性差，分離能力有限，并不具有廣泛的應用前景。

結晶紫或稱龍膽紫，屬堿性三苯甲烷類染料，具有高效的抗菌性，曾被廣泛應用于魚類疾病的抗菌藥。然而近年來，國內外研究者發現結晶紫通過生物體內轉化富集，具有“三致”效應，被列為水產養殖禁用藥物行列[16，17]。本文將毛細管電泳與光纖光譜儀器連接起來，構建一種新的聯用技術，采用紫外可見檢測構建毛細管電泳-光纖光譜儀聯用系統，并以結晶紫為模型化合物考察了聯用系統的條件。

1 實驗部分

1.1試劑

乙腈(色譜純)，結晶紫標準品、磷酸、磷酸二氫鈉、乙酸、乙酸銨等分析純試劑均產于天津科密歐公司，用水均為雙重蒸餾水。結晶紫標準儲備液(0.1 mg/mL)：準確稱取0.0100 g結晶紫標準品，用乙腈溶解并定溶至100mL.

1.2儀器與實驗條件

HR4000光纖光譜儀、DH2000 UV-VIS-NIR光源、CUV-CCE毛細管電泳通道均由美國Ocean Optic公司產，GY-6型高壓電源(東北大學分析科學研究中心)，石英毛細管柱19 cm×75 μm(河北永年光導纖維廠)。

1.3實驗方法

所有溶液使用前均用0.45 μm濾膜過濾，每次實驗前分別用0.1 mol/L NaOH，0.1 mol/L HCl，二次水，緩沖溶液沖洗毛細管各5 min，以0.1 mol/L，pH 4.0的磷酸緩沖溶液為緩沖介質，采用高度差進樣，進樣高度15 cm，進樣時間60 s，分離電壓3 kV，檢測波長590 nm，實驗溫度為室溫。

2 結果與討論

2.1儀器構造

自組裝毛細管電泳-光纖光譜聯用裝置如圖1所示。CUV-CCE接口固定于水平可移動板上，與Foret等人研制出的接口[18]相比，配套光纖通過特有的套管可保證光路準確通過毛細管光窗，消除電泳系統中的壓力限制，輕巧的設計方便拆卸和攜帶，具有更強的便攜性和儀器穩定性。

2.2緩沖溶液pH的優化

選用常見的毛細管區帶電泳緩沖溶液磷酸-磷酸二氫鈉做為緩沖介質，分別考察不同pH下樣品分離情況，分離電壓3 kV，進樣高度15 cm，進樣時間60 s，樣品濃度0.1 mg/mL，檢測波長590 nm.不同pH下電泳譜圖如圖2所示。

圖1 毛細管電泳-光纖光譜聯用裝置示意圖

圖2 pH優化電泳譜圖

結果表明，pH小于4.0時，柱效較差，而pH為4.5時，電流噪聲較大，信噪比較小，故選擇pH 4.0為最優緩沖pH.

2.3分離電壓的優化

考察了不同分離電壓時對分離效率的影響，樣品在pH為4.0的緩沖介質中，檢測波長為590 nm不同分離電壓的電泳譜圖如圖3所示。

由圖可知，當分離電壓為3 kV時，柱效高，出峰時間短，故選擇3 kV為最優分離電壓。

2.4緩沖介質的優化

考慮毛細管區帶電泳中常用緩沖試劑：磷酸鹽、硼酸或硼砂、醋酸鹽，由于硼酸鹽緩沖溶液pH范圍為堿性，不符合結晶紫分離需求。本實驗只對磷酸體系和醋酸體系進行考察。分別配制pH 4.0，1 mmol/L磷酸-磷酸二氫鈉和醋酸-醋酸銨為緩沖介質，對同一標準溶液進行電泳分離，分離電壓3 kV，檢測波長為590 nm，電泳譜圖如圖4所示。

圖3 電壓優化電泳譜圖

圖4 緩沖介質優化電泳譜圖

從圖中可以看出，當緩沖體系為醋酸-醋酸銨時，半峰寬較大，信噪比較小，故選擇磷酸-磷酸二氫鈉為緩沖體系。

2.5緩沖溶液濃度優化

考察了不同濃度的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液對分離效率的影響，選擇濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mol/L，pH為4.0的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液進行實驗，分離電壓3 kV，檢測波長590 nm。電泳譜圖如圖5所示。

圖中可見，當濃度為0.1 mol/L時，分離效率最高，濃度大于0.1 mol/L時，電流焦耳熱較大，管內易產生空泡，故選擇0.1 mol/L的磷酸-磷酸二氫鈉緩沖溶液為最佳濃度。

2.6進樣時間優化

由于自組裝毛細管電泳系統手動進樣誤差較大，選擇相對低的進樣高度和相對長的進樣時間可以減小系統誤差，考察了40、50、60、70、80 s五個不同進樣時間對分離效率的影響。所用緩沖體系pH=4.0，濃度為0.1 mol/L磷酸-磷酸二氫鈉緩沖，分離電壓3 kV，檢測波長為590 nm.電泳譜圖如圖6所示。

圖5 緩沖溶液濃度優化電泳譜圖

圖6 進樣時間優化電泳譜圖

圖7為不同進樣時間的峰高變化。由圖中可見，進樣時間為60 s時，峰高峰型均為最優，故選擇60 s為最佳進樣時間。

2.7標準曲線的繪制

取結晶紫母液分別稀釋至0.8、3、5、8、10 μg/mL，按照上述最優條件進行實驗，繪制出峰高Abs

與濃度c標準曲線和線性關系如圖9所示。計算得回歸方程為y=5.47X+0.0097，相關系數R2=

0.9954檢出限(S/N=3)為0.8 μg/mL，對5 μg/mL結晶紫平行測定5次，相對標準偏差為0.62%.

2.8樣品分析

本實驗條件下，未知水樣經0.45 μm濾膜過濾后，未檢測出結晶紫。在水樣中加入標準結晶紫溶液，回收率為95.23%～103.15%.實驗結果表明，該聯用體系穩定性良好，可用于實際樣品分析。

圖7 進樣時間對峰高的影響

圖8 濃度c與峰高Abs關系

3 結論

本文首次成功構建了毛細管區帶電泳-光纖光譜聯用快速檢測新方法，并以結晶紫為模型化合物對該方法進行考察，與文獻比照實驗檢出限相近(見表1)，該方法可對待測物進行快速準確的分析檢測。

表1 不同方法線性范圍和檢出限比較

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Detectionofcrystalvioletbycapillaryelectrophoresis-fiberopticspectrometer

HAN Yun, WEI Guo-fen, ZHANG Xia,LIAN Pan-pan, WANG Jin-li, LV Jian-quan

(Hubei Key Laboratory of Pollutant Analysis & Reuse Technology,Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

A novel method for the determination of crystal violet (CV) has been developed based the capillary electrophoresis - fiber optic spectrometer system. The conditions for the system and analysis of CV are experimentally investigated. The optimum conditions are as follow: mobile phase, 0.1 mol/L H3PO4-NaH2PO4buffer solution (pH 4.0), detection wavelength at 590nm in the visible region, separation voltage 3000V, and injection time 60s. Under the optimum conditions, the absorbance is proportional linearly to CV concentration in the range of 3 and 10 μg/mL, the correlation coefficient is 0.9954, and the detection limit was 0.8 μg/mL. This method has been successfully applied in rapid detection of CV.

detection; crystal violet; capillary electrophoresis; fiber optic spectrometer

2014—01—27

韓韻(1988— ),男，湖北省丹江口市人，碩士生，研究方向為基礎研究.

O657.8

A

1009-2714(2014)02- 0088- 05

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.02.020