人RANKL胞外結構域原核表達載體的構建及表達條件優化

張 琴，潘繼承，汪勁松

(湖北師范學院 生命科學學院， 湖北 黃石 435002)

人RANKL胞外結構域原核表達載體的構建及表達條件優化

張 琴，潘繼承，汪勁松

(湖北師范學院 生命科學學院， 湖北 黃石 435002)

細胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor activator of the NF-κB ligand , RANKL)是TNF超家族的重要成員之一，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，通過與其受體核因子κB受體活化因子(RANK) 構建的信號通路參與乳腺癌的發生、腫瘤骨轉移、骨質疏松、關節炎等病理過程。人RANKL胞外結構域基因片段與原核表達載體pET-21b融合并轉化至表達菌Rosetta，并對其表達條件進行了優化。通過對誘導時機，誘導溫度，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 濃度，誘導時間及甘油濃度的條件優化表明，當IPTG的濃度為0.2 mmol/mL, 20 ℃振蕩誘導培養6 h 時，甘油濃度為4%時，可在上清中獲得高效表達的pET-21b-RANKL融合蛋白，為該蛋白的進一步純化及結構與功能研究打下了良好的基礎。

人RANKL胞外結構域;大腸桿菌;重組蛋白;表達條件

細胞核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand, RANKL)，是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族成員之一，源于滑膜組織[1，2]，主要表達于破骨細胞前體細胞的表面，在淋巴組織(淋巴結、 胸腺、 脾、 胎肝)及骨組織(骨骼、骨髓)中含量高，而在心、胎盤、骨骼肌、胃和甲狀腺等非淋巴樣組織中僅有低度表達[3，4]。成骨細胞、 骨髓基質細胞、 軟骨基質周圍的原始間充質細胞和肥大型軟骨細胞T以及激活的淋巴細胞均表達RANKL[5]。

RANKL是由單個基因編碼。然而，可變剪接導致了三個亞型的表達。在人體中，有兩種亞型均為II型跨膜蛋白，分別含有317個氨基酸[6]和270個氨基酸，含有270個氨基酸的RANKL與含有317個氨基酸的區別僅在于具有較短的胞內結構域[7]。第三種亞型只含有243個氨基酸，沒有跨膜結構域和胞內結構域，而是一種可溶性蛋白，稱為sRANKL[7，8]。每一種亞型只有當他們各自聚合成同源三聚體以后才具有生物活性[9，10]。RANKL與其受體RANK以六聚體的形式結合并將信號傳遞至NF-κB信號通路，最終促進破骨細胞前體細胞的分化與成熟。因此，RANKL在破骨細胞增殖、分化、活化、存活以及腫瘤細胞凋亡、腫瘤發生、腫瘤轉移等一系列生理過程中起著十分重要的作用。

本研究首先通過基因工程技術將人RANKL基因克隆到原核表達載體上，再轉化到大腸桿菌Rosetta中，誘導使其表達目的蛋白。通過誘導時機、誘導溫度、IPTG 濃度、誘導時間、甘油濃度等五個影響因子對重組人RANKL胞外結構域的菌株進行可溶性表達及條件優化，旨在為該蛋白進一步的分離純化、功能鑒定和配體篩選奠定基礎。

1 材料與方法

1.1質粒與菌株

原核表達載體pET-21b、克隆菌株DH 5α、表達菌種Rosetta由實驗室保存。

1.2試劑及工具酶

Ex-Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶購自大連TaKaRa公司；限制性內切酶 NdeI、XhoI購自Sigma公司；蛋白質Marker購自上海生工生物工程有限公司；膠回收純化試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素(Amp)購自Amresco公司, 其余所用試劑均為國產或進口分析純試劑。

1.3引物設計與合成

根據在NCBI上人RANKL基因cDNA序列(GenBank 登陸號: NM_003701.3)的開放閱讀框設計，利用Primer 5軟件設計一對特異性引物。

上游引物：RANKL-F: 5'-GGAATTCCATATGAGAGCAGAGAAAGCGATGGT-3'

下游引物：RANKL-R: 5'- CCGCTCGAGATCTATATCTCGAACTTTAAAAG-3'

由上海生工生物工程有限公司合成。預期擴增片段 532 bp，其中在上游和下游引物5'端各引入Nde I和Xho I酶切位點(下劃線標出)和保護堿基。

1.4目的片段的擴增與回收

采用人工合成的人RANKL 基因作為模板進行 PCR 擴增。PCR 反應體系為：RANKL-F (10

μ mol) 0.5 μL, RANKL-R (10 μ mol) 0.5 μL, cDNA模板0.5 μL, 超純水11 μL, Mix混合物12.5 μL.

PCR 反應條件為：94℃預變性3 min;94℃變性 30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 35個循環；72℃延伸10 min. PCR 擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離，采用DNA 凝膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.5重組質粒pET-21b-RANKL的構建與鑒定

將回收的 PCR產物與pET-21b用Xho I和Nde I進行雙酶切，電泳檢測，將目的條帶切膠過柱回收DNA片段。在T4連接酶作用下將RANKL基因與線性pET-21b載體連接，構建表達載體pET-21b-RANKL，轉化 DH 5α后利用Amp抗性平板篩選陽性克隆進行PCR、雙酶切及測序(上海生工生物工程有限公司)鑒定，以確定開放閱讀框編碼正確。DH 5α的轉化參照文獻[5]進行。

1.6RANKL基因在大腸桿菌中的表達

將重組質粒pET-21b-RANKL 轉化至Rosetta感受態細胞，構建重組菌株 Rosetta/pET-21b-RANKL，挑取含陽性重組表達質粒的單克隆菌落接種于LB 液體培養基 (含Amp 100 μg/mL) 中，37℃活化過夜，再按1∶100 稀釋到LB 中，37℃培養至OD600約為0.6-0.8時，加入IPTG 至終濃度為1.0 mmol/mL , 于 37℃、200 rpm培養5 h , 將誘導表達后收集的菌體置于冰水浴中超聲破菌， 12000 rpm離心10 min , 取上清和沉淀與上述菌體一起進行15% SDS- PAGE電泳，分析目的蛋白的可溶表達情況，方法參照文獻[11]進行。

1.7重組菌株原核表達條件優化

將重組菌株Rosetta/pET-21b-RANKL按照1%接種量分別接種到含 100 mL LB液體培養基 (含Amp 100 μg/mL) 三角瓶中，做多個平行實驗，進行以下條件優化：

1) 誘導時機

在37℃條件下培養至OD600分別為 0.4、0.6、0.8和1.0時，加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/mL , 37 ℃繼續培養6 h.

2)溫度

在37 ℃條件下培養至 OD600為0.6時，加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/mL , 后將菌液均分為5份，分別于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃和 37 ℃誘導6 h.

3)IPTG 濃度

在37 ℃條件下培養至OD600為0.6 時，均分為6份，加入 IPTG 使其終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/mL , 37 ℃繼續培養6 h.

4)誘導時間

在37 ℃條件下培養至 OD600為 0.6時，加入 IPTG 使其終濃度為1.0 mmol/mL , 37 ℃繼續培養，分別于0、2、4、6、8 和10 h 取樣。

5)甘油含量

將重組菌株Rosetta/pET-21b-RANKL按照1%接種量分別接種到1個含 100 mL LB液體培養

基(含Amp 100 μg/mL)三角瓶中，于37 ℃條件下培養至OD600為0.6時，加入IPTG使其終濃度為

1.0 mmol/mL , 分別加入甘油，使其占總體積的2%、4%、6%、8%、10% , 37 ℃繼續培養6h.

上述條件下獲得的樣品，進行15% SDS- PAGE電泳，分析目的蛋白的可溶表達情況，方法參照文獻[11]進行。

2 結果與分析

2.1pET-21b-RANKL表達載體PCR和酶切檢測

由圖1可以看出，表達載體PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示，在550 bp左右的位置有清晰的特異性條帶；重組質粒經雙酶切后，得到大小約為550 bp和5300 bp的兩個片段，與預期結果一致(如圖2)；測序結果顯示RANKL基因開放閱讀框連接正確，說明已成功構建重組質粒pET-21b-RANKL.

圖1 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 重組質粒pET-21b-RANKL經NdeI/XhoI酶切后的瓊脂糖凝膠電泳

2.2重組質粒pET-21b-RANKL在Rosetta中的表達

由圖3中可以看出，Rosetta/pET-21b-RANKL重組菌株誘導后在20 kDa處有一條顯著表達條帶，與軟件預測大小相一致；經超聲破碎后電泳發現重組目的蛋白主要形成包涵體，可初步確定重組目的基因實現在E.coli 中的表達。

2.3重組菌株原核表達條件優化

1)誘導時機對重組蛋白表達的影響

選擇OD600為0.4-1.0的菌液分別進行誘導培養，圖4所示為不同菌液OD600誘導目的蛋白表達的差異性，誘導時機對重組蛋白表達量的影響較大，菌體的蛋白含量呈現先增加后下降的趨勢，當菌液OD600為0.6時，誘導菌體蛋白可溶性表達量最大。

2)誘導溫度對重組蛋白表達的影響

通過圖5的 SDS-PAGE電泳圖可以看出，誘導溫度對重組蛋白表達量的影響較大。在20 ℃條件下震蕩培養6 h后，可獲得較高的可溶性目的蛋白表達量。

3)誘導時間對重組蛋白表達的影響

由圖6可以看出，誘導兩小時后就有融合蛋白開始表達，隨著誘導時間的延長，可溶性蛋白表達量逐漸提高，在6 h時表達量最大，繼續延長誘導時間則蛋白表達量沒有繼續增加，而雜蛋白的量卻有所增加。

圖3 重組菌株Rosetta /pET-21b-RANKL 誘導蛋白表達的SDS-PAGE 圖( M． 標準蛋白marker; 1．未誘導上清; 2．未誘導沉淀; 3．誘導上清;4．誘導沉淀;黑色箭頭所示為目標蛋白)

圖4 Rosetta /pET-21b-RANKL在不同OD600誘導蛋白表達量的SDS-PAGE 圖( M． 標準蛋白marker; 1-4．重組菌株OD600值分別為0．4、0． 6、0． 8、1． 0 誘導6h;黑色箭頭所指為目標蛋白)

圖5 Rosetta /pET-21b-RANKL在不同誘導溫度下目的蛋白表達量的SDS-PAGE 圖( M． 標準蛋白marker; 1-5．重組菌株在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30℃、37 ℃誘導6h;黑色箭頭所指為目標蛋白)

圖6 Rosetta /pET-21b-RANKL在不同IPTG 濃度誘導下的蛋白表達量的SDS-PAGE 圖( M．標準蛋白marker; 1-．重組菌株在誘導時間分別為0、2、4、6、8、10 h 誘導;黑色箭頭所指為目標蛋白)

4)IPTG 濃度對重組蛋白表達的影響

通過SDS-PAGE電泳圖可以看出，重組菌株Rosetta/pET-21b-RANKL蛋白表達量在終濃度為0.2 mmol/mL時，可溶性蛋白表達量最大，繼續增加IPTG濃度并未出現表達量增加(見圖7)。

5)甘油含量對重組蛋白表達的影響

通過SDS-PAGE電泳圖可以看出，甘油含量對重組蛋白表達量的影響較大。在加入2%甘油下誘導，蛋白表達量增加，在4%的甘油誘導條件下，可溶性蛋白表達量最大(見圖8)。

3 討論

RANKL及RANKL/RANK/OPG系統目前已經成為代謝性骨疾病領域最引人關注的科研熱點[12]。目前關于RANKL在骨代謝系統和免疫系統中的作用、介導骨吸收的信號傳遞過程以及它與其它骨吸收調節因子的調控關系等有待于深入研究。采用基因工程的方法制備RANKL蛋白質可為其進一步研究奠定基礎。

本實驗所用的pET-21b即是一類高效融合蛋白表達載體。本研究在設計RANKL引物時，在上游引物RANKL-F和下游引物RANKL-R的兩端加入了限制性內切酶 Nde I和Xho I位點。通過酶切使目的片段和載體切成含粘性末端的DNA 片段，有利于下一步克隆連接。采用抗性篩選、PCR鑒定以及測序分析相結合的方法對重組質粒進行陽性篩選，增加了實驗結果的可靠性。

圖7 Rosetta/pET-21b-RANKL在不同的IPTG誘導濃度下蛋白表達量的SDS-PAGE圖 (M.標準蛋白marker;1-6.重組菌株在IPTG濃度為0.0 mM、0.2 mM、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1.0 mM誘導6 h;黑色箭頭所指為目標蛋白)

圖8 Rosetta/pET-21b-RANKL在不同濃度甘油誘導的蛋白表達量的SDS-PAGE電泳圖(M.標準蛋白marker;1-5;重組菌株在2%、4%、6%、8%、10%甘油;黑色箭頭所指為目標蛋白)

利用基因工程法獲得大量廉價的肽類物質和稀有蛋白，能夠解決天然資源匱乏分離純化困難化學合成昂貴等問題[13]。但是外源基因在異源表達時，受多種因素影響[14]。本實驗通過對誘導時機、誘導溫度、IPTG濃度、誘導時間及誘導時加入甘油含量等條件的摸索，找出最佳的誘導條件，對重組體在大腸桿菌中實現高效可溶性表達。當菌液OD600為0.6時誘導菌體蛋白表達量最高，OD值過低或過高都不利于蛋白的表達。因此過早誘導造成生物質和目的蛋白產量偏低，同時也增加了染菌的機會；誘導較晚雖可獲得高產量的生物質，但細胞表達外源蛋白的時間則減少，總的蛋白量仍然偏低。溫度可能是影響外源蛋白在大腸桿菌中獲得高水平表達的最重要因素之一[15]。本實驗結果表明20 ℃時目的蛋白表達量最高。溫度過高過低都會影響酶系統催化作用，從而降低目的蛋白的表達量。誘導時間的不同會影響到外源基因的表達以及工程菌的穩定性和活性。在本實驗中，隨著誘導時間的延長，目的蛋白的表達量逐漸增加，但是當誘導時間大于6 h后，目的蛋白的表達量逐漸減少，這與有關文獻報道一致[16]。當IPTG 濃度為 0.2 m mol/mL時目的蛋白表達量最高, 隨著 IPTG濃度增加目的蛋白表達量有下降趨勢，過高或過低都會影響目的蛋白的表達量。IPTG濃度較低時蛋白表達量較低，可能是誘導劑對T7啟動子的誘導強度較低所致；而較高濃度對目的蛋白表達的影響，可能是由于IPTG對細菌生長有一定的抑制作用導致[17]。甘油含量對重組蛋白表達量的影響較大。在甘油含量為4%時，可獲得較高的目的蛋白表達量，甘油含量過低或過高都可能會導致蛋白形成包涵體量的增加。

綜上所述，我們已經成功地構建了重組原核表達質粒pET-28b-RANKL.通過對重組菌株Rosetta/pET-28b-RANKL蛋白表達條件優化，確定了最佳誘導時機OD600及誘導時間分別為0.6和6 h, 最佳誘導溫度為20℃, 最佳IPTG濃度為0.2 m mol/mL, 最佳甘油含量為4%. 為該蛋白進一步的分離純化、功能鑒定和配體篩選奠定了基礎。

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TheconstructionofprokaryoticexpressionvectorandoptimizationofexpressionconditionsoftheextracelluarDomainofHumanRANKL

ZHANG Qin,PAN Ji-cheng,WANG Jin-song

(College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China)

The receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) is an important member of the TNF superfamily, which is a type II transmembrane protein, and its cognate ligand, RANK (receptor activator of nuclear factor-kappa B) built the signaling pathway in the occurrence of breast cancer, bone metastases, osteoporosis, arthritis and other pathological processes. In this article, the extracellular domain of human RANKL gene were cloned into prokaryotic expression vector pET-21b and transformed into the expression bacteria E. coli Rosetta. We successfully constructed recombinant human RANKL gene Rosetta/pET-21b-RANKL. And it was induced to express the target protein. We optimized its expression conditions. When the IPTG concentration was 0.2 mmol/mL, the induced timing OD600 for 0.6, oscillation induced culture for 6 h in 20 ℃ and glycerol concentration for 4%, we can efficiently expressed the extracellular domain of human RANKL fusion protein (pET-21b-RANKL) in the supernatant. It provided a foundation for further purification of the protein and researched its structure function.

the extracellular domain of human RANKL;Escherichia coil;recombinant protein;expression conditions

2013—04—28

張琴(1987— )，女，湖北十堰人，碩士，研究方向為蛋白質結構與功能.

Q7

A

1009-2714(2014)01- 0048- 06

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.01.010