下調(diào)Smad7表達對PC12細胞OGD損傷的影響

王一鳴,程 也,付丹陽,王勇濤,王姣琦,梅春麗, 莽 靖*,徐忠信*

(1.吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學院，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033 )

激活素A(ActivinA,Act A)是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，其作為 ActA/Smads信號通路的第一信使，通過觸發(fā)下游細胞內(nèi)Smads級聯(lián)反應，完成具有一定生物學功能的信號轉(zhuǎn)導過程[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)ActA/Smads通路具有抗缺血損傷的神經(jīng)保護作用[2，3]。但其相關信號轉(zhuǎn)導及調(diào)節(jié)機制尚需進一步研究，本研究以該通路中重要的細胞內(nèi)調(diào)節(jié)因子Smad7為靶點，利用RNA干擾技術抑制Smad7基因表達，檢測其對PC12細胞OGD損傷及ActA/Smads通路活化水平的影響，探討Smad7對ActA/Smads通路的調(diào)控機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞系購自中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫。兔抗大鼠ActA、Smad7、β-actin抗體購自Santa公司，羊抗兔二抗購自鼎國公司，鼠神經(jīng)生長因子(NGF)購自Sigma公司，Trizol 總RNA提取試劑盒購自上海生工公司，Quantscript cDNA合成試劑盒、Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒購自天根公司。Smad7和內(nèi)參GAPDH基因引物委托上海生工合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 PC12細胞培養(yǎng)及神經(jīng)元轉(zhuǎn)化含10%馬血清及15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)PC12細胞，2-3天換液后，當細胞接近80%融合時，胰酶消化傳代。細胞貼壁后加入終濃度為50 ng/ml 的NGF，連續(xù)刺激7天以誘導細胞神經(jīng)元樣轉(zhuǎn)化[4]。

1.2.2 氧糖剝奪模型的建立 神經(jīng)元樣PC12細胞經(jīng)含有10%胎牛血清和1.0 mol/L Na2S2O4的無糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)16 h，建立OGD16 h組[4]。

1.2.3 大鼠Smad7基因的siRNA合成 設計大鼠Smad7基因的siRNA，正義鏈5’-aacgaucugcg cucguccggcgudtdt-3’；反義鏈3’-dtdtuugcuagacgcgagcaggccgca-5’。 SiRNA及陰性對照基因序列委托吉凱生物有限公司合成。

1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染及分組 24孔板內(nèi)細胞80%融合時行轉(zhuǎn)染，于前一天將培養(yǎng)液更換為不含血清及抗生素的高糖DMEM，分別轉(zhuǎn)染靶向Smad7基因的siRNA，陰性siRNA及對照PBS，建立陽性轉(zhuǎn)染組，陰性轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染濃度50 nM，24 h后行OGD16 h。

1.2.5 Smad7基因mRNA的表達檢測 收集細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應用ABI7500Fast 型實時熒光定量PCR儀對Smad7基因及內(nèi)參GAPDH mRNA的表達進行檢測。引物序列如下：Smad7 上游 5'-TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC-3'，下游5'-AGT AAGGAGGAGGGGGAGAC-3'，片段大小：104 bp；GAPDH上游5'-GGT TACCAGGGCTGCCTTCT-3'，下游5'-ATGGGTTTCCCGTTGATGAC-3'，片段大小：171bp。結果應用Relative Quantification (ddCt) Study軟件行相對定量分析。檢測實驗重復三次。

1.2.6 MTT細胞存活率檢測 三組細胞以1×104個/孔接種于96孔板，每組10個復孔，各組隨機選擇5個復孔行OGD16 h，每孔加人20 μl的MTT(5 mg/ml)37℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，加入200 μl的二甲基亞砜溶解藍紫色結晶，充分振蕩溶解，應用酶標儀在490 nm激發(fā)波長測吸光度(A)。OGD16 h的A值與OGD0h的A值比較，計算每組細胞存活率。檢測實驗重復三次。

1.2.7 Smad7和ActA的蛋白水平檢測 神經(jīng)元樣PC12細胞，經(jīng)OGD16h處理的陽性及陰性轉(zhuǎn)染組細胞分別消化離心，利用含有1% PMSF的RIPA裂解提取總蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，而后分別用兔抗大鼠Smad7(1∶500)和ActA(1∶500)一抗4℃過夜孵育，洗膜，羊抗兔二抗(1∶500)37℃孵育2 h，ECL顯影壓膠片。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Smad7 siRNA沉默效果檢測

應用Real Time RT-PCR檢測Smad7 mRNA的表達變化，陽性轉(zhuǎn)染組Smad7 mRNA表達水平(0.32±0.13)較陰性轉(zhuǎn)染組顯著下調(diào)(0.68±0.14)(見圖1)。

* 與陽性轉(zhuǎn)染組比較P<0.05

2.2 Smad7 及ActA蛋白水平的表達檢測

siRNA轉(zhuǎn)染24 h，Smad7及ActA蛋白表達檢測顯示：OGD16h，siRNA陽性轉(zhuǎn)染組Smad7蛋白表達(0.35±0.08)與陰性組(1.17±0.12)比較，顯著下調(diào)。OGD后ActA蛋白表達上調(diào)，以陽性轉(zhuǎn)染組為著(對照組：0.94±0.10，陰性轉(zhuǎn)染組+OGD16h：1.29±0.13，陽性轉(zhuǎn)染組+OGD16h：2.46±0.16)(見圖2)。

圖2 Smad7、ActA 蛋白表達檢測

2.3 細胞存活率MTT檢測

OGD16h后MTT細胞存活率檢測結果顯示：陽性轉(zhuǎn)染組(90.68%±1.31%)與陰性轉(zhuǎn)染組(80.56%±2.13%)及空轉(zhuǎn)染組相比(78.3%±1.72%)，存活細胞比例顯著升高(見圖3)。

* 與陽性轉(zhuǎn)染組比較P<0.05

3 討論

國內(nèi)外研究及本課題組的前期工作均證實ActA的抗缺血損傷神經(jīng)保護作用。目前研究表明，其信號轉(zhuǎn)導機制主要為Smads家族蛋白將胞外信號傳遞至胞內(nèi)繼而調(diào)控核內(nèi)基因的表達[4]。在該通路信號轉(zhuǎn)導過程中，Smads蛋白作為重要結點，一方面，膜受體激活的Smads2/3和通用Smads(common mediator Smads，Co-Smads)作為信號轉(zhuǎn)導通路的細胞內(nèi)傳遞因子發(fā)揮著級聯(lián)反應功能，另一方面通過抑制性Smads(Smad6/7)，抑制該通路的激活過程[5，6]。在非神經(jīng)細胞模型的研究中，Smad7主要通過與抑制性Smads競爭結合TGF-βI型受體以及促進TGF-βI型受體去磷酸化而發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用[7，8]。但Smad7基因?qū)ι窠?jīng)細胞缺血性損傷及其相關的ActA/Smads通路活化的影響目前尚不明確。為此，本研究利用RNA干擾技術，體外設計合成靶向大鼠Smad7基因的siRNA，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術，瞬時轉(zhuǎn)染神經(jīng)元樣PC12細胞，繼而對Smad7在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平的表達、細胞對OGD損傷的敏感性及ActA/Smads通路的活化水平進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，PC12細胞經(jīng)外源性siRNA瞬時轉(zhuǎn)染后，經(jīng)實時定量PCR及蛋白印記檢測均證實細胞內(nèi)Smad7基因在mRNA及蛋白水平的表達均明顯下調(diào)，細胞OGD損傷后的存活率升高，與陰性轉(zhuǎn)染組及空轉(zhuǎn)染組相比有顯著差異。

本研究進一步對ActA蛋白的表達情況進行了檢測，以明確ActA/Smads通路的活化水平,結果顯示OGD損傷刺激激活了調(diào)細胞內(nèi)初級ActA蛋白合成，且此過程受Smad7基因的負向調(diào)節(jié)。考慮到細胞外ActA是該信號通路的始動因素，目前研究結果提示了ActA/Smads通路活化可能存在著一定程度的環(huán)路(反饋)調(diào)節(jié)，在OGD損傷過程中通過正反饋促進ActA基因表達，維持通路活性，但該機制又受到Smad7基因的負性調(diào)控，其途徑一方面可能是通過經(jīng)典機制下調(diào)通路活化程度，另一方面可能也與Smad7可以結合核內(nèi)DNA，干擾可發(fā)揮生物學功能性的Smads-DNA復合物形成有關[9]。但Smad7對ActA/Smads通路調(diào)控的確切機制仍有待于在時間水平上對神經(jīng)細胞缺血損傷這一動態(tài)過程中不同時間位點以及空間水平上在細胞核內(nèi)的進一步探討和研究。

作者簡介：王一鳴(1993-)，男，吉林長春人，吉林大學白求恩醫(yī)學部臨床醫(yī)學專業(yè)本科生。

參考文獻：

[1]Massagué J,Seoane J,Wotton D.Smad transcription factors[J].Genes Dev,2005,19(23):2783.

[2]Schubert D,Kimura H,LaCorbiere M,et al.Activin is a nerve cell survival molecule[J].Nature,1990,344(6269):868.

[3]He Jin-Ting,Mang Jing,Mei Chun-Li,et al.Neuroprotective Effects of Exogenous Activin A on Oxygen-Glucose Deprivation in PC12 Cells[J].Molecules,2011,17(1):315.

[4]Mukerji SS,Rainey RN,Rhodes JL,et al.Delayed activin A administration attenuates tissue death after transient focal cerebral ischemia and is associated with decreased stress-responsive kinase activation[J].J Neurochem,2009,111(5):1138.

[5]Schmierer B,Hill CS.TGF beta-SMAD signal transduction: molecular specificity and functional flexibility[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(12):970.

[6]Mukerji SS,Katsman EA,Wilber C,et al.Activin is a neuronal survival factor that is rapidly increased after transient cerebral ischemia and hypoxia in mice [J].J Cereb Blood Flow Metab,2007,27(6):1161.

[7]Kato S,Ueda S,Tamaki K,et al.Ctopic expression of Smad7 inhhibit strans-forming growth factor responses in vascular smooth muscle cells[J].Life Sci,2001,69(22): 2641.

[8]Ebisawa T,Fukuchi M,Murakami G,et al.Smurf1 interacts with transforming growth factor-beta type I receptor through Smad7 and induces receptor degradation[J].J Biol Chem,2001,276:12477.

[9]Zhang S,Fei T,Zhang L,et al.Smad7 antagonizes TGF-β signaling in the nucleus by interfering with functional Smad-DNA complex formation[J].MCB,2007,27(12):4488.