黃芪對大鼠海馬齒狀回區氨基酸物質含量的影響

李光燮，王 師，王 丹，李英順，金清華*

(1.延邊大學醫學院 生理學與病理生理學教研部，吉林 延吉133002；2.延邊大學臨床學院)

海馬是哺乳類動物完成學習記憶功能的關鍵結構[1]，海馬的三個亞區及其相關神經網絡在各種學習記憶中起著不同的作用[2]：①齒狀回(DG)區在傳入信息的編碼中有重要作用；②CA3區在工作記憶和短時程記憶的鞏固和再現中起關鍵作用；③CA1區對中時程記憶的鞏固和再現很重要。文獻報道，損毀大鼠海馬DG區可導致學習記憶功能的損害[3，4]，提示海馬DG區作為信息進入海馬的傳入點，對信息進行處理和編碼，在學習記憶中起著至關重要的作用。研究表明，海馬內氨基酸類物質的改變可影響學習記憶能力[5]，我們先前的研究也表明，海馬DG區內的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)和牛磺酸(Tau)的含量在回避性條件反射建立過程中明顯增加[6]。

黃芪(Radix Astragali)系多年生草本植物，又叫北芪、綿芪等，為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，其成分主要有多糖、黃酮類和皂苷類等[7]。黃芪作為一味常用中藥，始載于《神農本草經》，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效。研究表明，黃芪還具有抗疲勞、抗病毒感染、調節血糖、抗腦缺血缺氧、抗氧化、增加機體免疫力、提高記憶力等諸多功效[8]。雖然黃芪因其抗氧化、抗腦缺血缺氧等作用在增強學習記憶能力的研究上備受關注，但是到目前為止，關于黃芪對海馬區氨基酸類物質的釋放是否有影響未見報道。因此，本實驗利用穿梭箱觀察大鼠學習記憶能力的基礎上，主要利用腦部微量透析法和高效液相色譜法觀察了黃芪水體液對海馬DG區細胞外液中的氨基酸類物質含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠24只，體重為200±20 g，由延邊大學醫學部實驗動物科提供。動物隨機分成3個組，即對照組、黃芪小劑量組(1.5g/kg)、黃芪大劑量組(4.5g/kg)，每組各8只。

1.2 黃芪水提取物的制備及灌胃

長白山道地黃芪，4-5年生。先將藥材浸泡24小時，然后煎煮3次，每次加入10倍黃芪量的水，每次煎煮120 min，將3次濾液混勻，濃縮制得浸膏，4℃冰箱儲存備用。開始實驗時，用生理鹽水稀釋浸膏，制備0.6 g/ml和1.8 g/ml的黃芪水體液，分別用在黃芪小劑量和大劑量組。采用無損傷灌胃針每次灌胃0.5 ml相應溶液(對照組用生理鹽水)，每日1次，持續3周。

1.3 實驗方法

1.3.1 手術及DG區微量透析過程 大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)進行腹腔麻醉，腹臥位固定于立體腦定位儀上，參照Paxinos和Watson大鼠腦圖譜，將透析用外套管(內徑 0.50 mm,外徑0.70 mm)插入到DG上1 mm處(前囟向后3.4 mm,正中線旁開2.2 mm,深度 2.5 mm),并用牙托粉固定于顱骨表面。經透析用外套管將自制的微量透析探針垂直插入到DG區，并用蠟固定。探針超出套管1.0 mm，其前端有外徑0.2 mm的乙酸纖維素半透膜(DM-22，Eicom,日本)，可濾過分子量小于50000的物質。微量透析探針連接于微量泵(ESP-64，日本Eicom公司),以1.5 μl/ min的速度灌流改良Ringer’s液(147 mM NaCl，4 mM KCl，2.3 mM CaCl2，pH 6.5),穩定60 min后,經自動收集器(EAS-20，Eicom，日本)收集微量透析樣本,每管樣本收集10 min,每只動物收集3個管,取平均值。樣本收集結束后，拔出探針，外套管封好，大鼠回籠恢復。術后第二天開始灌胃，持續3 w。灌胃結束后，大鼠水合氯醛麻醉，經外套管將微量透析探針重新插入到DG區，收集海馬DG區微量透析樣本(方法同上)，然后進行穿梭箱訓練。

1.3.2 微量透析樣本中的6種氨基酸含量的測定 每管樣本取12 μl和3 μl的OPA溶液在室溫下反應2.5 min后,抽取10 μl注入到生物活性物質微量分析系統 (HTEC-300，日本Eicom公司),以0.5 μl/min的速度流過高效液相色譜分離柱和電化學檢測器分析出氨基酸類物質的濃度,包括天冬氨酸(Aspartate,Asp)、谷氨酸(glutamate,Glu)、谷氨酰胺(glutamine,Gln)、甘氨酸(glycine,Gly)、牛磺酸(taurine,Tau) 和丙氨酸(Alanine,Ala)(圖1)。

圖1 海馬DG區6種氨基酸的典型高效液相色譜圖

1.3.3 行為學檢測 穿梭箱是一長方體箱子，中間用一隔板分開，隔板底部中間有一個半圓型洞，使兩個隔間相通，動物可通過此洞在兩隔間自由穿梭。每天的穿梭訓練過程如下：將大鼠置于其中一個間隔，適應3 min，先給5 s聲音刺激，再給10 s電刺激(如果動物穿過洞口，達到另一隔間，就結束該次聲音或電刺激)，間隔20 s，重復相同刺激，共20次。每天進行一次穿梭訓練，連續訓練5天。每天完成20次訓練所需要的時間作為大鼠學習記憶能力的指標。

1.4 組織學鑒定

實驗結束后，動物過量麻醉處死，取腦固定在10%的福爾馬林溶液中，3天后進行冠狀面的冰凍切片(厚度約60 μm)、中性紅染色，光學顯微鏡下進行組織學鑒定，確定透析探針的位置是否在DG區。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 組織學鑒定

大鼠腦標本與Paxinos & Waston大鼠腦圖譜進行對比，確認微量透析探針的位置(圖2)，透析探針未進入海馬DG區者不計入統計。

2.2 黃芪水提取液對大鼠海馬DG區氨基酸類物質含量的影響

圖2 標記微量析透析探針在DG區位置的典型顯微組織圖

大鼠在灌胃開始之前測定海馬DG區細胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly、Tau和Ala含量，結果顯示，每種氨基酸含量在各組之間沒有顯著性差異(均為P>0.05，表1，2)。對照組利用生理鹽水灌胃3w，灌胃前后DG區細胞外液中的6種氨基酸含量沒有顯著的變化(均為P>0.05，表1，2)。黃芪小劑量組和黃芪大劑量組利用黃芪水提液灌胃3w，灌胃前后海馬DG區細胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly和Ala的含量沒有出現明顯的變化(均為P>0.05，表1，2)。

黃芪小劑量組大鼠海馬DG區細胞外液中Tau的含量，給藥前為0.84±0.05 μmol/L，而灌胃后為0.99±0.06 μmol/L，兩者有顯著性差異(P<0.05，表1)。黃芪大劑量組海馬DG區細胞外液中Tau的含量，灌胃前為0.80±0.08 μmol/L，而黃芪水提液灌胃后為0.98±0.09 μmol/L，灌胃前后比較有顯著性差異(P<0.05，表1)。對照組大鼠生理鹽水灌胃前后，海馬DG區的Tau含量無明顯變化(P>0.05，表1)。利用黃芪水提液灌胃3w后，大鼠DG區細胞外液中的Tau含量明顯增加，和對照組相比有顯著性差異(P<0.05，圖3)。

表1 黃芪對大鼠海馬DG區Asp、Glu、Gln含量的影響 (μmol/L)

表2 黃芪對大鼠海馬DG區Gly、Tau、Ala含量的影響 (μmol/L)

*P<0.05，與灌胃前比較

圖3 黃芪水提液對海馬DG區細胞外液中的

以大鼠灌胃前的Tau含量作為100%，計算出灌胃后的Tau含量百分比。 #P<0.05，與對照組相比。

2.3 黃芪水提取液對大鼠學習記憶的影響

灌胃3w后，大鼠每天完成20次的穿梭訓練,連續訓練5天。對照組在整個訓練期間，每天訓練所需時間無明顯變化(P>0.05)；黃芪小、大劑量組的每天訓練所需時間逐漸縮短，到第四、第五天，訓練所需時間與第一天比較有顯著性差異(均為P<0.05)，與同一天的對照組相比，也有顯著性差異(均為PP<0.05)(圖4)。

3 討論

黃芪是一味常用中藥，其成分主要有多糖、黃酮類和皂苷類等，而且還含有硒、鋅、鐵等14種微量元素[7]。研究表明，黃芪可通過抑制鈉泵活性、減少能量代謝障礙、清除氧自由基等途徑促進腦血管再生、減少腦細胞凋亡，進而改善腦缺血缺氧損傷后的學習記憶能力[9]。本實驗結果也顯示，用黃芪水提液灌胃的大鼠在穿梭訓練過程中出現訓練所需時間的明顯縮短，提示黃芪可以提高其回避反應的學習記憶能力。雖然這些都提示黃芪可提高學習記憶能力，但黃芪對海馬區氨基酸類物質的影響報道較少。因此，本實驗觀察了黃芪對海馬DG區氨基酸類物質含量的影響。

圖4 黃芪水提液對穿梭訓練中的每天訓練所需

學習和記憶屬于腦的高級功能，學習指人或動物從外界環境獲取新信息的過程，記憶是指大腦將獲得的信息進行編碼、貯存和提取的過程，二者密不可分。眾所周知，海馬是哺乳類動物學習記憶的關鍵結構，研究表明，海馬內的氨基酸類物質參與學習記憶功能[5]，而且腦缺血常伴有氨基酸類物質的增加[10]。海馬DG區在新信息的處理和編碼中起著至關重要的作用[2]，而我們先前的研究證明，在大鼠回避反應學習過程中伴有海馬DG區內氨基酸類物質的增加[6]。為了進一步探討黃芪對學習記憶的改善作用是否與海馬內的氨基酸類物質有關，本實驗利用腦部微量透析法和高效液相色譜法測定了海馬DG區細胞外液中的Asp、Glu、Gln、Gly、Tau和Ala的含量。結果發現，黃芪可明顯增加大鼠海馬DG區Tau含量。

Tau是一種結構簡單的β-氨基酸，在中樞神經系統中主要分布在大腦皮質、海馬、小腦等區域，可能作為神經遞質或調質起作用。文獻報道，Tau可促進神經系統的生長發育、增強學習記憶能力、對缺血和驚厥等引起的神經元損害具有對抗作用，而且Tau與Glu關系密切，在大腦中二者水平呈高度正相關，Tau可通過抑制Glu的活性來減輕Glu的神經毒性作用[11，12]。另外，Tau能增加海馬和皮層內Fos蛋白、B-EP，AVP的含量，這與學習記憶能力的調節有關[13]。因此，我們推測黃芪改善大鼠的學習記憶能力，可能與海馬DG區Tau含量增加有關，但其下游的機制有待于進一步深入研究。

作者簡介：李光燮(1973-)，男， 博士研究生，研究方向為神經生理學。金清華(1971-)，女，博士學位，教授，博士生導師, 研究方向為神經生理學。

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