黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

杜聞博，巴圖烏力吉，佟淑平

(內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼028000)

腦血管疾病(crebrovascular disease，CVD)是指腦血管病變所引起的腦功能障礙。腦血管病變是指由于栓塞和血栓形成導致的血管腔閉塞、血管破裂、血管壁損傷或通透性發生改變、凝血機制異常、血液粘度異常或血液成分異常變化引起的疾病，與心臟病、惡性腫瘤構成了人類的三大死因[1]。

近年來隨著溶栓治療技術的發展，腦缺血后血流重建再灌注性腦損傷的相關研究己取得了顯著的進展，臨床適用的腦保護和預處理藥物，應具備副作用小，使用方便，患者接受性好等特點。蒙藥 (黑蘇嘎-25)主治脈病、偏癱、半身不遂等臨床療效顯著，主要成分有石決明、麝香、牛黃、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、蓽撥、肉桂、黑種子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，藥理具有良好的抗腦缺血損傷作用。黑蘇嘎-25成份是從天然產物中提取，具有副作用小且作用多途徑、多靶點，可針對腦缺血性變化的多個環節。

本項目擬采用Zea Longa[2]等的改良的線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血2 h再灌注24 h模型，以蒙藥(黑蘇嘎-25)進行干預治療，觀察神經功能缺損程度，測定腦梗死體積，檢測血清中TNF-α、IL-1β表達水平的變化，揭示黑蘇嘎-25對實驗性大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，初步探討其作用機理，為蒙藥治療腦缺血再灌注損傷提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 試驗動物 選用健康雄性Wistar大鼠60只，體重約230±20 g，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，許可證號碼:SCXK(吉)-2011-0004。大鼠飼養于適宜溫度及濕度的動物室中，處于相同飼養環境且自由攝食和飲水，自然晝夜(術前12 h禁食水)。

1.1.2 藥品及主要試劑 黑蘇嘎-25 (0.2 g/粒，內蒙古民族大學附屬醫院制劑室生產)；腫瘤壞死因子-a試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司，美國進口分裝)；白細胞介素-1β試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司，美國進口分裝)；紅四氮唑(氯化-2，3，5-三苯基四氮唑，TTC)：天津市福晨化學試劑廠；水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司。

1.1.3 主要儀器 手術顯微鏡(吉祥鳥牌，江蘇鎮江中文光學儀器有限責任公司)；全自動多功能酶標儀 (MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬蘭)；高速冷凍離心機 (BG10-3A，北京時代北利離心機有限公司)；-80℃低溫冰箱(Dw-GLZ18，北京中科美菱低溫科技有限責任公司)；10 cm眼科剪(YZB/滬1195-04A-2009，上海醫療器械有限公司手術器械廠)；電子天平(0.19，上海精密科學有限公司)；電子天平 (0.000019AUW120D，日本島津制作所試驗計測事業部)；電熱恒溫培養箱(BDR-82，上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；顯微手術器械14 Cm彎直鑷(金鐘牌手術器械，上海醫療器械集團有限公司手術器械廠)；醫用圖像分析系統(BI-2000，成都泰盟科技有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1 動物分組 60只健康雄性Wistar大鼠，雌雄各半，體重約230±20 g，隨機分成5組，每組12只。

假手術組：假手術+生理鹽水灌胃；模型組：缺血再灌注+生理鹽水灌胃；治療組(黑蘇嘎-25高劑量)：缺血再灌注+高劑量黑蘇嘎-25灌胃；治療組(黑蘇嘎-25中劑量)：缺血再灌注+中劑量黑蘇嘎-25灌胃；治療組(黑蘇嘎-25低劑量)：缺血再灌注+低劑量黑蘇嘎-25灌胃。

1.2.2 給藥方法 假手術組：生理鹽水5 ml/kg·d；模型組：生理鹽水5 ml/kg·d；黑蘇嘎-25高劑量治療組：360 mg/kg·d；黑蘇嘎-25中劑量治療組：180 mg/kg·d；黑蘇嘎-25低劑量治療組：90 mg/kg·d，溶于和假手術組等體積的生理鹽水，用前搖勻。灌胃(ig)給藥，每天1次，連續7 d。

1.2.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備 模型組與用藥組Wistar大鼠于最后1次灌胃后2 h參照 Zea Longa[2]等的改良的線栓法制備大腦中動脈栓塞(MCAO)模型：用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉(ip)大鼠，仰位固定，用醫用碘伏消毒頸前部，在頸正中行長約2 cm切口，鈍性分離，暴露左側頸總動脈(Common Carotid Artery ，CCA)和分叉部，分離分叉處的頸外動脈(External Carotid Artery ，ECA)和頸內動脈(Internal Carotid Artery ，ICA)，分離ECA分支枕動脈、甲狀腺上動脈，依次結扎CCA近心端、枕動脈、甲狀腺上動脈，并在遠心端剪斷枕動脈、甲狀腺上動脈，在甲狀腺上動脈分支之后結扎頸外動脈近心端和遠心端，自中間剪斷。拉直近心端剪斷的ECA，使ECA與ICA處于同一直線上，微動脈夾暫時性夾閉ICA遠心端，于ECA距CCA分叉5 mm處附近，在ECA剪一“V”口，將線栓向頸內動脈顱方向插入16-18 mm(線栓直徑0.24 mm，頭端0.30 mm)，注意不要誤入翼腭動脈，可感到阻力而無法向前推進時停止，將線栓固定在ECA上，縫合手術切口，栓線尾部伸出皮下1 cm左右便于拔栓線，缺血2 h后，外拉栓線0.5 cm，從而實現24 h再灌注。假手術組僅暴露左側頸總動脈，其余不做任何處理。

模型成功的標志是大鼠左眼出現Horner征；提尾時右前肢內收屈曲；爬行時向右側傾倒或按順時針方向轉圈，不成功者予以剔除，并隨機補充。

1.2.4 標本的收集與處理 假手術組在手術后2 h，其余各組模型制備成功后，再達到各自再灌注時間點24 h時，經10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，腹主動脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進行左心室灌流固定，至流液透明，斷頭取腦，行TTC染色，測定腦梗死體積。

1.2.5 神經功能缺損評分 參照Longa等[3]的5分制評分標準對麻醉蘇醒后的大鼠進行神經功能缺損評分：無神經病學征象記為0分；提尾時病灶對側前肢不能完全伸直為1分；向癱瘓側旋轉為2分；向病灶對側跌倒為3分；無自發活動及意識障礙者為4分。評分為5分、4分和0分的大鼠剔除。

1.2.6 腦梗死體積測定(TTC染色法，即氯化-2，3，5-三苯基四氮唑染色) 假手術組在術后2 h，其余各組在模型制備成功后，達到各再灌注時間點24 h時，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內注射深度麻醉，腹主動脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進行左心室灌流固定，至流液透明，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余用排刀冠狀切成8片，每片厚度約2 mm，置于2%TTC溶液中，37℃電熱恒溫培養箱避光染色30 min，4%多聚甲醛液中固定24 h后數碼相機照片后(見圖2)，用醫用圖像分析系統(BI-2000，成都泰盟科技有限公司)處理照片，測量腦梗死面積，根據公式：

V=t(A1+……+A5)

計算腦梗死體積比，其中t為腦片厚度，A為梗死面積，腦梗死體積比與全腦體積之比為梗死體積百分比。

1.2.7 血清中TNF-α、IL-1β水平的表達 假手術組在術后2 h，其余各組在模型制備成功后，達到各再灌注時間點24 h時，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內注射深度麻醉，腹主動脈取血5 ml，在4℃冰箱內沉淀24 h后，3 000 d/min離心10 min留取上清液，-80℃低溫冰箱保存備用。根據試劑盒說明書用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平。

2 結果

2.1腦缺血再灌注后神經功能缺損評分

腦缺血2 h，再灌注24 h后，大鼠神經功能缺損癥狀主要表現為提尾時右前肢內屈曲收，肌力、肌張力降低，側推阻力降低，活動減少，向右側追尾轉圈，伴或不伴有左側Horner征。假手術組無神經功能缺損癥狀，評分均為0分；與假手術組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25低劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25高劑量)均有明顯的神經功能缺損癥狀，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25低劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25高劑量)神經功能缺損程度均有所減輕，并隨著藥物劑量的增加，神經功能缺損評分減少，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(見表1)，具有顯著性差異，有統計學意義(P<0.05)。

2.2黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗死體積的影響

假手術組腦組織呈均勻紅色無梗死灶；模型組和治療組可見梗死蒼白區域位于右側額頂葉皮質下部和紋狀體外側區。與假手術組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均有明顯的白色梗死灶，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均使梗死灶體積減小，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯，(見表1)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷血清中TNF-α表達的影響

與假手術組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)血清中TNF-α水平的表達明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均使血清中TNF-α水平的表達降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(見表1)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷血清中IL-1β的影響

與假手術組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)血清中IL-1β水平的表達明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均使血清中IL-1β水平的表達降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(見表1)，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 腦缺血再灌注后神經功能缺損評分、腦梗死體積、TNF-α、IL-1β表達的比較

注：a與假手術組比較P<0.05，b與模型組比較P<0.05。

3 討論

3.1腦缺血再灌注損傷

腦缺血是指腦血流量的減少或血流中斷，再灌注是指腦缺血后血流減少區域的血流增加或產生血流的復通。溶栓、抗血小板和抗凝治療后，在血流復通實施再灌注的同時，又會在某些情況下(如炎癥反應)加重已缺血細胞、組織的進一步損傷。通過藥物干預等方法減輕這種損傷程度，可達到較為理想的治療目的。本實驗研究結果顯示，模型組在缺血2 h，再灌注24 h后，形成了再灌注損傷，表現為出現神經功能缺損癥狀，腦組織出現梗死灶及血清中TNF-α、IL-1β水平表達增強；在治療組，神經功能缺損有所減輕，梗死灶體積縮小，血清中TNF-α、IL-1β水平表達增減弱，達到了藥物干預的保護作用。

3.2黑蘇噶-25的藥理作用

蒙藥民間有許多成方可以治療缺血性腦血管疾病，但蒙醫臨床上最常用的只有三種：珍寶丸、扎沖十三味和黑蘇噶-25，這三種藥中黑蘇噶-25研究的最少，可能與藥物成分多，利用現代工藝難以提取有效成分，而且價格昂貴有關。參照《中國藥典》2005年版，蒙藥黑蘇嘎-25，性味咸寒，具有解毒，愈傷，除協日烏素，清腦退翳，主治白脈病，中風，偏癱、半身不遂腦傷，協日烏素病，眼翳白斑，骨折，創傷，頸強等功效[4]。主要成分有石決明、麝香、牛黃、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、蓽撥、肉桂、黑種子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，藥理具有良好的抗腦缺血損傷作用。本實驗通過藥理試驗中動物間和動物與人體間的等效劑量換算表，根據人的用藥劑量換算出Wistar大鼠的用藥劑量，并以此標準確定為Wistar大鼠用藥的中劑量治療組，此標準二倍就是高劑量，1/2就是低劑量。從而得出黑蘇嘎-25高劑量治療組：360 mg/kg·d；黑蘇嘎-25中劑量治療組：180 mg/kg·d；黑蘇嘎-25低劑量治療組：90 mg/kg·d。

3.3TNF-α與腦缺血再灌注損傷

TNF-α是 Garwell 等在1975年發現的一種能使腫瘤發生出血壞死的物質，主要由活化的單核-巨噬細胞分泌，也可以由抗原刺激的 T 細胞、活化的NK細胞、肥大細胞分泌，屬于多肽類激素，具有廣泛的生物學功能，主要與炎癥及免疫反應，研究表明腦缺血早期TNF-α的表達迅速增加是腦梗死形成的主要原因[5]，主要源于梗死灶的神經元、星型細胞、小膠質細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等。Liu[6]等人用Northern blot方法觀察到在缺血后1 h缺血側神經元即有TNF-αmRNA的表達,24h達高峰。本實驗結果顯示，模型組在大鼠腦缺血2h再灌注24 h時，TNF-α的含量明顯高于假手術組，提示腦缺血再灌注過程中TNF-α的表達水平增加；治療組在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h時，TNF-α的含量明顯低于模型組。說明黑蘇嘎-25能減少腦組織中TNF-α的表達水平，對腦缺血再灌注后的損傷具有腦保護作用。

3.4IL-1β與腦缺血再灌注損傷

IL-1β是IL-1基因家族成員中研究最多的一個亞類，它是由單核巨噬細胞合成分泌的強烈趨化因子，廣泛作用于血管內皮細胞，導致血栓形成，誘導小膠質細胞釋放細胞因子、自由基等促進腦缺血后炎癥介質的損傷作用，引起神經元損傷。IL-1β還能增加細胞間黏附分子(ICAM-1)在腦缺血中的表達水平。ICAM-1可介導白細胞和內皮細胞的緊密黏附，阻塞微血管，降低腦血流。本實驗結果顯示，模型組在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h時，IL-1β的含量明顯高于假手術組，提示腦缺血再灌注過程中IL-1β的表達水平增加；治療組在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h時，IL-1β的含量明顯低于模型組。說明腦缺血再灌注損傷能減少腦組織中IL-1β的表達水平，對腦缺血再灌注后的損傷具有腦保護作用。

3.5黑蘇嘎-25預處理對腦缺血再灌注損傷的影響

本實驗取清潔級健康Wistar大鼠60只，分為假手術組、模型組、黑蘇嘎-25低劑量組、黑蘇嘎-25中等劑量組、黑蘇嘎-25高劑量組，灌胃給藥7天，制備MCAO大鼠模型，通過行為學判斷神經功能評分、組織病理學測定腦梗死面積、ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-1β水平，結果顯示，治療組(黑蘇嘎-25高劑量組、黑蘇嘎中劑量組、黑蘇嘎低劑量組)的神經功能缺損程度評分均較模型組明顯改善，且隨著藥物濃度的增高神經功能缺損程度評分較少；治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均較模型組的腦梗死灶體積減小，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯；可見黑蘇嘎-25的應用明顯改善了腦缺血的神經損傷程度及減少了腦梗死灶體積，對腦缺血再灌注損傷具有保護作用。模型組、治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)TNF-α陽性細胞數量均有增加，說明在缺血性腦損傷過程中，可能是抑制了TNF-α活性而產生明顯的神經保護作用[7]，從而減輕腦缺血再灌注所造成的神經功能損傷。治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)較模型組中的TNF-α、IL-1β陽性細胞數明顯減少，證實黑蘇嘎-25是可能是通過抑制TNF-α、IL-1β表達的增強來發揮神經保護作用。由此可見，抑制TNF-α、IL-1β的表達，是黑蘇嘎-25對鼠腦缺血再灌注后腦保護作用機制之一。

4 結論

4.1 黑蘇嘎-25能夠減少局灶性腦缺血大鼠的神經功能缺損評分及縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，降低局灶性腦缺血后血清中TNF-α、IL-1β水平。

4.2 抑制TNF-α、IL-1β的表達，可能參與了黑蘇嘎-25對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦保護作用。

作者簡介：杜聞博，32歲，男，碩士學位，醫師，腦血管病；佟淑平，35歲，女，碩士學位，主治醫師。

參考文獻：

[1]張振強，宋軍營，賈亞泉.缺血性腦血管疾病研究進展[J].河南大學學報(醫學版)，2012,31(4):312.

[2]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middlecerebralar teryocclusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989，20(1)：84.

[3]Zea Longa E，Weistein pR，CalsonS，et al.Reversble middle cerebral artery occlusion Without craniectomy in rats[M].Stroek，1989，20(1)：84.

[4]國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草·蒙藥卷[M].上海:上海科學技術出版社,429．

[5]劉一鷗，金便芬，張林靜，等.腦梗死患者血漿脂聯素和腫瘤壞死因子-α與病情輕重的關系[M].中國全科醫學，2007，10(20)：1681.

[6]蔡世昌，白 波，張秋玲.腦缺血再灌注后神經細胞再生研究進展[J].解剖學研究，2012，34(1):54.

[7]劉永琦,吳曉晶,董介正等.補腎方藥血清孵育BMSCs移植對腦缺血大鼠腦組織細胞凋亡的影響[J].中國老年學雜志,2011,31(3):458.