微管相關蛋白-2表達的變化對海馬梗死大鼠學習記憶能力的影響研究

金翊思,袁 波

(1.哈爾濱醫科大學附屬第五醫院 康復醫學科，黑龍江 大慶163000；2.大慶市油田總院 肺科與職業病科二病房，黑龍江 大慶163000)

腦缺血導致患者的運動功能障礙，其功能的恢復可通過再學習而獲得，但由于患者多同時存在記憶功能的障礙，嚴重影響患者提高自身的軀體運動功能，更影響其生活質量。目前，針刺、康復訓練治療缺血后記憶能力障礙的效果較好，但相關作用機制還不明確。為此，本實驗以針刺結合康復訓練作為干預手段，探討針灸結合康復的方法對海馬梗死大鼠的MAP-2表達和學習記憶能力的影響，并試探性闡述其作用機制[1，2]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

所選試驗動物由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供[許可證號scxk(京)2009-0001]，均為健康清潔級雄性SD大鼠，共50只，體重200g-250 g。將大鼠隨機分為模型組、假手術組、針刺組、康復組和針刺結合康復組(簡稱“針康組”)，每組10只大鼠。采用光化學法誘導海馬缺血模型。各組于術后24 h進行干預。

1.2 主要儀器、試劑

選購于國藥集團化學試劑有限公司的虎紅粉劑；由哈爾濱工業大學提供的冷光源；選購于華北正華生物儀器設備有限公司的Morris水迷宮；選購于淮安市天劍工具廠的Y-型迷宮；購自美國Stant公司的MAP-2一抗試劑盒，產品(批號2005070)；購自北京中山試劑公司的二抗試劑盒，產品(批號2005012)。

1.3 制備模型

光化學法誘導法：用10%水合氯醛按35 mg/kg腹腔注射將大鼠麻醉，于俯臥位將大鼠放置在腦立體定位儀上，沿頭部正中將大鼠頭皮切開，暴露顱骨到前囟點，在前囟點后3.5 mm、中線向左旁開2.0 mm處，用牙科鉆鉆開一個直徑為1 mm的骨窗，將光纖管尾端探至硬膜下3.3 mm處。用生理鹽水稀釋虎紅，濃度為1.5%，按70 mg/kg 于腹腔注射，注射時間為2 min。5 min后照射局部海馬組織。照射時間5 min。手術結束后縫合頭皮，正常喂養。假手術組僅進行常規麻醉(沿頭顱切開頭皮，用牙科鉆在前囟后3.5 mm、中線向左旁開2.0 mm處鉆孔，然后縫合頭皮)。

1.4 干預方法

針刺組：大鼠術后24 h參照于致順頭部腧穴七區劃分法和《大鼠穴位針灸圖譜》，選擇0.25 mm×15 mm針具取頂區進行針刺，進針深度3-10 mm，留針6 h。康復組：大鼠術后24 h進入Morris水迷宮接受訓練，從平臺所在象限外的其他3個象限，隨機選擇一個入水點，并記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間，即潛伏期。將大鼠面向池壁放入池中，如果大鼠2 min內找不到平臺，就將大鼠放到平臺上停留30 s，后將其放回籠中。此種情況潛伏期記為120 s。訓練時依次從3個不同的入水點入水，每次大鼠的入水點相同，訓練的順序固定。每日訓練1次。主要訓練大鼠的游泳和學習記憶功能能力。針康組：大鼠術后24 h后每日針刺留針6 h，Morris水迷宮訓練1次。模型組：術后自然恢復，不進行任何干預。

1.5 標本采集及指標檢測

1.5.1 標本采集 干預14 d后，于大鼠檢測行為能力后灌注取材。按大鼠0.35 ml/100 g體重的劑量，腹腔注射10%水合氯醛0.5 ml，將大鼠深度麻醉，打開胸腔，暴露心臟，將灌注針刺入心尖，沿左心室將管插至主動脈，固定插管，剪開右心耳，先灌注0.9%的生理鹽水，見右心耳流出澄清液體，再灌注200 ml，濃度為4%多聚甲醛固定液。完成灌注后將大鼠斷頭取腦，所取組織放于4%福爾馬林溶液中固定24 h。24 h后乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(從視交叉水平開始進行冠狀切片，厚度為5 μm)，采用免疫組織化學(S-P)法染色。

1.5.2 指標檢測 將包埋的腦組織切片，石蠟切片先經二甲苯脫蠟，再梯度酒精脫水；取過氧化氫去離子水孵育，以阻斷內源性過氧化物酶；枸櫞酸微波修復。滴加一抗(1∶50)，4℃下冰箱過夜，PBS沖洗，2 min×3次；滴加二抗，37℃下孵育20 min，PBS沖洗，2 min×3次；滴加DAB顯色劑；后用蒸餾水進行充分沖洗，蘇木素復染，用鹽酸乙醇分色、藍化；后梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。統計陽性細胞數，將制成切片置于放大鏡下(放大倍數為10×40)隨機選5個視野，顯色者為陽性，對每個視野內的陽性細胞數進行統計。

1.6 評估學習記憶能力

采用Y-型迷宮：Y-型迷宮是一個三等臂式迷宮，每臂頂端設有信號燈，將安全臂信號燈點亮，危險臂不點亮信號燈。訓練中每次無規則選取一安全臂。大鼠在通電后從所在臂跑到亮臂記為正確，如跑到暗臂記為錯誤。每天分段訓練大鼠，每段10次，兩段間隔2 min。如連續10次測試中有9次正確表明大鼠已掌握迷宮結構，記錄大鼠掌握迷宮結構所需的訓練次,表明學習能力越強的大鼠訓練次數越少。以此可判斷大鼠學習分辨能力。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 學習記憶能力的評估

Y-迷宮試驗結果顯示，各組大鼠的分辨學習能力明顯下降(與假手術組比較)，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，干預組學習能力均有所恢復，差異有統計學意義(P<0.05)，且針康組療效最佳，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠學習記憶能力比較次)

2.2 免疫組化檢測海馬MAP-2的表達

梗死灶周圍MAP-2陽性細胞明顯增多。各組大鼠的MAP-2表達較假手術組明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，各干預組表達更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，針康組最佳，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠MAP-2表達檢測結果個)

3 討論

頭針作為一種整體性治療配合康復治療，使患者的大腦皮層在單位治療時間內獲得更大的刺激量，激發大腦皮層相對無效的或新形成的通路，使原先未承擔此功能的結構去承擔新的、不熟悉的任務，從而實現對大腦的重塑。臨床實踐中我們也發現，針灸結合康復之路可同時提高患者的肢體運動能力及認知能力，兩方面功能的提高均優于單純的針灸或康復訓練，尤其是頭針治療(其中以前額部腧穴為主)療效最為突出。可見，針康法將改善患者肢體運動功能及學習功能，這正符合現代偏癱康復中的提高運動整合水平的理念[3]。目前，針灸配合運動訓練的治療方法在臨床已取得良好療效，被稱作“新趨勢針灸”(NTA)[4]。本實驗采取術后24 h干預14天，是因為有研究表明，腦缺血后神經元樹突生長發生可能在1周以后，而運動訓練對其生長有明顯的促進作用[5]。

MAP-2是一種熱穩定的磷蛋白，哺乳動物腦中含量豐富，是神經細胞的骨架成分，主要在神經元胞體、樹突和樹突棘表達，能調節微管蛋白組裝,是動力學的重要調節因子，常被用來作為神經元的標志蛋白[6-9]。根據Briones等[10]研究發現，短暫性腦缺血后的大鼠的表達增加，并同時表現出大鼠在水迷宮行為學參數的變化，提示MAP-2可能發揮了提高神經功能的作用。

本實驗結果顯示，腦缺血后大鼠的分辨學習的能力明顯下降。針刺、康復訓練以及針刺結合康復均能促進學習能力的恢復，但針康法療效最佳。免疫組化結果顯示，與假手術組比較，各組大鼠的MAP-2表達均較對照組明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，受干預組表達更明顯，差異具有統計學意義(P<0.05)，且針康組效果最明顯，差異具有統計學意義(P>0.05)。表明單純康復訓練、單純針刺與針刺結合康復訓練均能明顯促進神經元樹突發芽和再生，進一步促進新的突觸形成，而后者作用更明顯。本實驗中MAP-2蛋白表達增加的同時有腦梗死大鼠行為學的改善，并且與學習記憶功能的恢復呈正相關。表明針刺結合康復訓練可明顯促進腦缺血大鼠神經功能，改善學習記憶能力。進而促進其軀體運動功能恢復的效率，提高生活質量。在今后的實驗中，我們爭取能夠對腦卒中患者的其他功能康復做更為廣泛的深入研究。

參考文獻：

[1]趙振峰，金翊思.針康法對局灶性海馬缺血大鼠學習記憶能力及突觸素表達的影響[J].中國康復理論與實踐，2012,2,18(2)：101.

[2]Andersen G，Vestergaard K，Ingemann-Nielsen M，et al.Risk factors for post-stroke depression [J].Acta Psychiatr Scand，1995，92(3)：193.

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[4]陸 敏,張蘇明,常立英,等.強化運動訓練對腦缺血再灌注大鼠運動功能及MAP-2表達的影響[J].中國康復醫學雜志，2009，24，(2)：99.

[5]劉正清，馬志健.微管相關蛋白2與神經元可塑性調節CJ7[J].中國現代醫學雜志，2003,13(9):51.

[6]李愛群，周建偉.微管動力學相關蛋白的研究[J].細胞生物學雜志，2003,23，(2)：78.

[7]Dehmelt L,Halpain S.The MAP 2/Tau family of microtubule-associated proteins[J].Genome Biol,2005,6(1):204.

[8]Atalay B,Caner H,Can A,et al.Attenuation of microtubule associated protein-2 degradation after mild head injury by mexiletine and calpain-2 inhibitor [J].Br J Neurosurg,2007,21(3):281.

[9]Briones TL,Woods J,Wadoska M,et al.Amelioration of cognitive Impairment and changes in microtubule-associated protein 2 after transient global cerebral ischemia are influenced by complex Environment experience [J].Behav Brain Res,2006(168):261.

[10]Briones TL,Woods J,Wadowska M,et al.Amelio-ration of cognitive impairment and changes in micro-tubule-associated protein 2 after transient global cerebral ischemia are influenced by complex environment experience[J].Behav Brain Res,2006,168(2):261.