臍帶間充質干細胞對腦梗死大鼠行為學及膽堿能的影響

賈芙蓉，張貫石，王 輝，潘洪濤，何 欣，張 東，丁冬梅

(1.解放軍第二〇八醫院 檢驗科，吉林 長春130062；2.吉林大學 白求恩醫學部基礎醫學院，吉林 長春130021；3.解放軍第65316部隊醫院；4.解放軍第65571部隊 衛生隊)

腦梗死導致的腦部血液供應障礙、缺血、缺氧可引起腦組織壞死，會出現相應的神經功能障礙，導致行為學的改變。全部的運動神經都屬于膽堿能神經。乙酰膽堿(Ach)是乙酰膽堿能神經元系統的神經遞質，與膽堿能系統功能的損害程度密切相關[1]。Ach由乙酰膽堿酯酶(TChE)分解，通過Ach受體發揮生物效應。黑質多巴胺能神經元的樹突或胞體含有大量TChE，能夠將TChE分泌到細胞外液中。TChE直接參與植物神經功能調節、肌肉運動、大腦思維、記憶等重要功能。TChE活力有改變時，以上各組織器官功能也會改變。TChE參與細胞的發育和成熟，能促進神經元發育和神經再生。通過測定TChE和Ach的活性可反映腦內膽堿能系統的功能。

我們在體外成功培養出人臍帶間充質干細胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)的基礎上[2]，將UC-MSCs經尾靜脈注入腦梗死大鼠體內，觀察大鼠行為學、腦2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染色及膽堿能的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

2，3，5—氯化三苯基四氮唑(TTC)，美國Sigma公司。乙酰膽堿酯酶(TChE)試劑盒，南京建成生物化學試劑有限公司生產，批號：2010727。乙酰膽堿(Ach)試劑盒，南京建成生物工程研究所產品，批號：20120808?？捡R斯亮藍蛋白，南京建成生物化學試劑有限公司生產，批號：20100520。CO2恒溫培養箱，上海申工。 YJ-1450超凈工作臺，蘇州潔諾公司。101-1-BS-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進。4℃冰箱，星星公司。DL-5000冷凍離心機，上海菲恰爾公司。R450型酶標儀，Bio-Rad公司。天池魚線，日本橫濱產，直徑0.28 mm，栓線的頭端用酒精燈火焰燒，使之成球形。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，2-3月齡，體重250-350 g，購于吉林大學動物實驗中心。實驗用鼠均飼養于解放軍第二〇八醫院動物實驗中心級潔凈空調實驗動物室。在(22±2)℃，濕度為(50±5)%的環境下標準鼠食喂養，飲用水為自來水。12 h光照，12 h黑暗。

1.3 實驗動物的分組及模型復制

1.3.1 SD大鼠54只，隨機分為3組，即臍帶間充質干細胞(UC-MSCs)移植組(以下簡稱UC-MSCs組)、模型組、假手術組，每組18只大鼠。

1.3.2 UC-MSCs組及模型組的復制模型參照Longa等[3]方法，并改進陳佳俊等[4]的方法，栓塞大鼠右側大腦中動脈。假手術組：僅分離頸總及頸外動脈，結扎大腦中動脈，不插入魚線。

1.4 MCAO模型大鼠標準檢測

于大鼠造模清醒后30 min，根據Persson[5]的方法對大鼠進行神經病學分級，分級標準如下：0級：正常；Ⅰ級：對側前肢屈曲；Ⅱ級：提尾時，對側前肢抓力減弱；Ⅲ級：自主運動無方向性，提尾時向對側旋轉；Ⅳ級：自主運動時，向對側旋轉。選擇Ⅲ級及以上模型大鼠進行治療。各組大鼠在移植后第10天進行行為功能檢查。

1.5 方法

1.5.1 UC-MSCs的原代培養、傳代、收集細胞 按照本實驗室實驗方法進行[2]。

1.5.2 細胞移植 MCAO模型建立后24 h，將UC-MSCs組制成單細胞懸液，經大鼠尾靜脈UC-MSCs組緩慢注入含有細胞1×106/ml生理鹽水溶液1 ml，腦梗死組注入生理鹽水1 ml。

1.5.3 移植后腦梗死模型大鼠的行為學與運動功能觀察 各組大鼠于造模后24 h、尾靜脈注射后第10天以平衡木實驗檢測大鼠的運動功能。采用平橫木行走實驗(Beam walking Test，BWT)[6]，即大鼠于200 cm×10 cm×1 cm橫木。距地面高40 cm，以10°角度向下爬行，在造模前訓練3 d，連續3次評分達9分方進入本試驗。

評分標準如下：在30 s內爬過橫木，左側后肢少于2次內滑倒計9分；在30-90 s內爬過橫木，左側后肢少于2次滑倒計8分；在90s內爬過橫木，長于50%距離正確用左側后肢爬行計7分；短于50%距離正確用左側后肢爬行計6分；左側后肢能置于橫木上，向前爬行時均下滑計5分；在90 s內爬過橫木，左側后肢不能置于橫木上計4分；90 s內爬過30%橫木計3分；90 s內爬過30%橫木，不能在橫木上停留90 s計2分；爬過短于30%橫木，能在橫木上停留90 s計1分；爬過短于30%橫木，不能在橫木上停留90 s計0分。

1.5.4 TTC染色觀察腦組織變化 分別在移植術后第20天每組隨機抽取一只處死，全部動物均按規定斷頭，腦組織取出后即置于-20℃低溫冰箱快速冷凍后，從前腦額級開始行冠狀切片，由前向后間隔切取組織片5片，每片約2 mm，置2%TTC生理鹽水中37℃孵育30分鐘，待顯色完全，取出中間腦片在自然光線下數碼相機照相。

1.5.5 TChE活力的測定和Ach含量的測定 尾靜脈注射UC-MSCs第10天，行為學檢測結束后，每組每次取9只大鼠腹主動脈采血并斷頭取其治療前、后腦組織。血液經肝素抗凝(每亳升血液含20單位肝素)，離心分離血漿。斷頭處死大鼠，在冰臺上取出大鼠海馬，快速分離雙側海馬結構制備勻漿，TChE試劑盒、Ach試劑盒分別測定腦組織和血漿中乙酰膽堿含量和乙酰膽堿酯酶活性，蛋白測定采用考馬斯亮藍法。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 行為學，術后動物行為表現

大鼠造模清醒后30 min，模型組大鼠頭偏向患側，患側眼裂變窄，患側肢體無力，提尾時向對側旋轉。假手術組未見行為異常。移植第10天，除假手術組外，各組大鼠神經功能評分逐漸增高，第10天MSC組與模型組的評分比較差異有統計學意義(P<0．05)。三組比較結果見表1。

表1 各組大鼠平衡木實驗運動功能評分結果

注：與假手術組相比，*P<0.01；與模型組相比，▲P<0．05

2.2 TTC染色

TTC染色大鼠正常腦組織染色呈紅色，梗死區呈白色。用AutoCAD軟件計算和測定腦組織梗死面積和總腦片面積，以腦梗死面積占總腦片面積百分數(%)表示，見圖1、圖2。梗死面積比較采用t檢驗，治療后20天UC-MSCs組與造模后24 h模型組相比，P<0.01，結果見表2。

注：箭頭所指位置為腦梗死區域

2.3 TChE和Ach測定

UC-MSCs移植對腦梗死大鼠海馬區和血漿中TChE和Ach均有影響。結果見表3，UC-MSCs組與模型組相比，海馬TChE活性明顯增高，P<0.05；UC-MSCs組與模型組相比，海馬Ach活性明顯增高，P<0．05。

圖2 UC-MSCs治療20天后腦梗死大鼠腦組織TTC染色，×200

組別腦梗死面積模型組24 h25.30±7.6UC-MSCs組治療20天0.55±0.36*

注：與模型組24 h腦梗死面積相比，*P<0.01

分組乙酰膽堿酯酶(TChE)乙酰膽堿(Ach)假手術組1.42±0.15 20.58±1.81模型組1.00±0.17*16.67±1.75*UC-MSCs組1.38±0.20▲ 20.06±1.78▲

注：與假手術組相比，*P<0．05；與模型組相比，▲P<0．05

表4表明，UC-MSCs組與模型組相比，血漿TChE活性明顯增高，P<0．05；UC-MSCs組與假手術組相比，P>0．05 ；UC-MSCs組與模型組相比，血漿Ach活性明顯增高，P<0．05。

分組乙酰膽堿酯酶(TChE) 乙酰膽堿(Ach)假手術組6.74±0.52 11.31±1.31模型組5.62±0.56* 8.02±1.35*UC-MSCs組7.03±0.69▲ 12.06±1.65▲

注：與假手術組相比，*P<0．05；與模型組相比，▲P<0．05

3 討論

外周神經和中樞神經組織有一定的再生能力，這些神經纖維或細胞體內部都含有高水平的TChE。神經損傷早期TChE在神經元胞體和近端軸突內的活性增強。TChE可能參與膽堿能神經遞質的傳遞，還具有調節和促進神經組織的發育和神經再生的神經營養因子樣作用。

神經細胞死亡導致的神經功能缺陷，至今尚無有效的治療方法。間充質干細胞是一類起源于中胚層的成體干細胞，可以從骨髓、脂肪、胎盤、臍帶血以及臍帶中分離出來，具有自我更新、高度增殖和多向分化的潛能。人臍帶間充質干細胞比來源于骨髓、胎盤及其他組織的MSCs更具有優勢，如臍帶的來源不受倫理爭議，成本較低；UC-MSCs具有低免疫原性、免疫調節、基質支持、旁分泌、遷移和基因穩定性，故具有良好的臨床治療潛能。目前，已有多種方法成功地將UC-MSCs誘導為神經元和膠質細胞，還可分化為特定類型的神經元細胞[7-10]。這種潛能，使其具有作為種子細胞應用于修復或替代受傷和病變的神經組織，從而為腦梗死等一些神經系統難治性疾病的治療提供了一個新的途徑。

本研究結果顯示，腦梗死大鼠海馬、血漿內TChE和Ach活性下降，提示存在膽堿能系統異常。UC-MSCs經靜脈移植后20天，可改善腦梗死大鼠行為功能，增強海馬TChE和Ach活性，說明UC-MSCs移植能明顯改善膽堿能系統的功能和行為能力，達到治療腦梗死的目的，這可能與其提高膽堿能神經系統的活性和UC-MSCs在腦內存活并分化為新生的神經元有關。有報道，bFGF治療血管性癡呆大鼠，癡呆組大鼠海馬TChE活性較假手術組明顯升高，治療組大鼠海馬TChE活性較癡呆組降低[11]。大鼠血管性癡呆與腦梗死模型同樣引起神經元受損，但TChE變化不同，相關機理待進一步研究。

有研究發現體外培養的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)能夠分泌多種白細胞介素、巨噬細胞克隆刺激因子、Flt-3配體及干細胞因子等[12]，這些細胞因子可促進鼠類海馬神經前體細胞的生存、生長及分化[13]。體內實驗研究顯示BMSCs還可增加腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)、血管內皮生長因子(VEGF)的分泌[14]。這些營養因子促使宿主內源性的神經干細胞或神經前體細胞向成熟神經元分化，其中包括膽堿能神經元，從而使Ach水平增加， TChE活性上調。因此，BMSCs移植改善膽堿能神經系統功能的原因可能與這些因子的分泌有關，UC-MSCs移植是否有相同作用，其有關機理有待進一步研究。

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