嚴重少精子癥及無精子癥的遺傳學分析

楊會林，董 晶

(北京大學深圳醫院 檢驗科，廣東 深圳518036)

據世界衛生組織(WHO)統計，全世界約有10%-15%的育齡夫婦患有不孕不育癥，其中由男性因素導致的不育癥約占30%-50%，同時30%以上的男性不育癥患者是由于遺傳學異常導致生精功能障礙引起[1]，在臨床上主要表現為嚴重少精子癥(精子密度<5×106/ml)和無精子癥(精液離心后鏡檢未發現精子)。染色體異常是造成男性不育的重要遺傳學因素，據統計，在男性不育患者中，染色體異常的發生率為2%-5%，在少精子癥和無精子癥中更高達15%[2]。Y染色體為男性特有，與男性特異的遺傳學性狀密切相關，Y染色體與男性不育的關系一直是男科學的研究重點，尤其是對Y染色體長臂(Yq11)上的無精子因子(azoospermia factors,AZF)區域缺失的研究。AZF分為4個區域，即AZFa區、AZFb區、AZFc區、AZFd區，AZF任何一個座位的缺失都可能導致生精功能障礙[3]。本研究對142例嚴重少精子癥和178例無精子癥患者進行細胞遺傳學和Y染色體AZF微缺失分析，以便為患者明確診斷，對患者進行正確的生育指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和主要儀器 外周血淋巴細胞培養基購自德國Cytogen公司；全血DNA提取及AZF檢測試劑購自亞能生物技術(深圳)有限公司；PCR儀購自美國ABI公司；凝膠成像分析系統購自美國BioRad公司。

1.1.2 研究對象 142例嚴重少精子癥和178例無精子癥患者來自我院生殖中心及遺傳咨詢門診。所有患者均按照WHO(2010)精液常規分析標準規定，連續3次精液分析，精子密度<5.0×106/ml的患者診斷為嚴重少精子癥；精液離心沉淀鏡檢未見精子的患者診斷為無精子癥，并選取100例精液參數正常男性作為AZF微缺失檢測正常對照。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 無菌操作采集研究對象的肝素抗凝靜脈血2-3 ml用于染色體檢查，EDTA抗凝靜脈血2-3 ml用于AZF微缺失檢測。

1.2.2 外周血細胞培養染色體分析 無菌操作抽取0.4 ml肝素抗凝全血置于淋巴細胞培養基中，混勻后置5%CO2培養箱恒溫37℃培養72 h，制備染色體標本，G顯帶。油鏡下分析5個分裂相，計數30個分裂相。有嵌合核型時加計數至100個分裂相，必要時加做C顯帶、N顯帶進一步分析。根據ISCN2009人類細胞遺傳學國際命名體制命名。

1.2.3 Y染色體AZF微缺失檢測 使用深圳亞能生物技術有限公司Y染色體微缺失基因檢測試劑盒，采用多重PCR方法對DNA進行AZF微缺失檢測，檢測位點包括AZFa區：SY82、SY84、SY86；AZFb區：SY124、SY127、SY128、SY133、SY134、SY143；AZFc區：SY239、SY242、SY254、SY255；AZFd區：SY145、SY152，共15個位點，每個PCR反應體系里均有Y染色體性別決定基因(SRY基因)做內控，并設置陽性對照(正常男性DNA)和陰性對照(超純水)。擴增條件：50℃ 10 min；95℃ 10 min；94℃ 30 s；58℃ 60 s；72℃ 60 s；共35個循環，72℃延伸10 min。擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳至溴酚藍遷移出2-3 cm，在紫外燈下觀察、拍照記錄結果。

2 結果

2.1 外周血染色體檢查結果

142例嚴重少精子癥患者檢出23例異常核型(16.20%)，178例無精子癥患者檢出35例異常核型(19.66%)。兩組患者染色體異常核型比率均高于正常人群核型異常比率(0.38%)[4]。所有異常核型中，Klinefelter綜合征14例，占異常核型總數的24.14%；其它性染色體異常28例，占異常核型總數的48.28%；常染色體異常16例，占異常核型總數的27.59%。在所有58例異常核型患者中，24例臨床表現為嚴重少精子癥，34例表現為無精子癥；15例檢出AZF缺失，43例無缺失，見表1。

表1 嚴重少精子癥和無精子癥患者染色體檢查結果

2.2 Y染色體AZF微缺失檢測結果

在142例嚴重少精子癥患者中，檢出14例AZF微缺失，缺失率為9.86%；在178例無精子癥患者中，檢出20例AZF微缺失，缺失率為11.24%。經χ2檢驗分析發現，嚴重少精子癥患者組和無精子癥患者組的缺失率無統計學差異，上述兩組分別與精液參數正常組相比較均有顯著差異(P<0.005，表2)。

表2 正常精液患者、嚴重少精子癥患者、無精子癥患者Y染色體微缺失檢測結果

注：與正常精液組比較，*χ2=10.48，P<0.005；#χ2=12.10，P<0.005；均有顯著差異。嚴重少精子癥組與無精子癥組比較，χ2=0.16，P>0.05，無顯著差異。

3 討論

引起男性不育的因素很多，其中由遺傳因素導致生精功能障礙是引起男性不育的重要原因之一。目前研究的主要遺傳因素包括染色體核型異常及Y染色體AZF微缺失。

染色體異常可以不同程度地影響到精子的發生，進而影響男性的生育能力。在正常人群中染色體異常的發生率約為0.38%[4]。本研究320例無精子癥及嚴重少精子癥患者中，共檢出染色體異常核型58例，檢出率為18.13%，明顯高于正常人群水平，說明男性不育與染色體異常有密切關系。本研究所有染色體異常核型中，Y染色體異常出現頻率最高(29例)，占異常核型總數的50.00%。Y染色體是男性特有染色體，其長臂上有精子分化和發育相關基因，Y染色體的缺失、倒位、易位、異染色質區的異常都可能導致這些基因的缺失或異常表達，導致精子生成障礙或影響精子的受精能力；本研究檢出Klinefelter綜合征14例，占異常核型總數的24.14%，所有患者臨床表現均為無精子癥。該病的發病機制是生殖細胞減數分裂時X染色體不分裂，形成了染色體異常卵子與Y精子受精，該型患者成年后睪丸曲精管發生萎縮和玻璃樣變性，不能產生精子；本研究還檢出常染色體異常16例，提示常染色體異常也跟精子發生有關[5]。精子生成受到諸多有序表達的基因的控制[6]，據估計有2000個基因調節精子生成，這些基因絕大部分位于常染色體上，常染色體的異常可能影響這些基因的功能，進而影響精子的發生。

AZF為多基因家族，編碼RNA結合蛋白并調節RNA的代謝、修飾、運輸、剪切以及基因表達。有研究表明，大約6.7%的無精癥及3.6%的少精癥患者存在AZF微缺失[7]。本研究320例男性不育患者AZF微缺失檢出率與上述報道基本符合。既往研究認為，AZFa區缺失患者臨床主要表現為唯支持細胞綜合征，AZFb區缺失的患者主要表現為生精阻滯，主要停留在精母細胞和精子細胞階段，AZFc區缺失的患者臨床主要表現為不同程度的少精子癥，AZFd區則被認為是AZFb區和AZFc區之間的一個重疊區域。還有研究認為唯支持細胞綜合征的患者也存在AZFb區、AZFc區缺失，而AZFa區或AZFb區完全缺失以及更大片段缺失的患者，通過睪丸精子穿刺或經皮穿刺附睪抽吸取精術也很難獲得精子[8,9]。本研究142例嚴重少精子癥患者中，AZF基因存在b區、c區及d區缺失，其中以c+d區缺失為主，未發現有a區缺失，還發現1例3區(b+c+d)大片段缺失；178例無精子癥患者中，a區、b區、c區及d區四個區域均檢出缺失，其中檢出b+c+d區缺失8例，a+b+c+d缺失2例，3區以上大片段聯合缺失占總缺失的50.00%。比較兩組檢測結果，雖然嚴重少精子癥患者組和無精子癥患者組的缺失率無統計學差異，但無精子癥患者AZF基因3區以上大片段缺失比例明顯高于嚴重少精子癥患者組，表明基因缺失越多對精子發生的影響越大。本研究一共檢出20例AZFc+d區聯合缺失，其中12例臨床表現為嚴重少精子癥，8例表現為無精子癥，表明相同AZF位點缺失患者的遺傳學效應存在個體差異，需進一步研究。

本研究28例Y染色體核型異常患者中，15例檢出AZF微缺失，13例未檢出缺失；而34例AZF微缺失患者中，15例患者檢出Y染色體核型異常，19例正常。上述數據表明，Y染色體核型正常患者可能存在AZF缺失，而Y染色體核型異常患者AZF基因不一定缺失。故對于男性不育患者，同時檢測染色體核型和AZF基因微缺失，可以提高診斷效率。

通過對男性不育癥患者染色體和Y染色體長臂AZF微缺失的檢測，可以從細胞水平和分子水平探索精子發生機制，以及因生精障礙導致男性不育的真正原因，從而制定相應治療措施，減少無謂的檢查，避免不必要的藥物和手術治療；另一方面，也可以對希望接受輔助生育技術，特別是為行ICSI患者提供遺傳信息參考，使其做出選擇，避免子代遺傳負荷增加，為優生優育提供可靠的遺傳依據，具有重要的臨床意義。

參考文獻：

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