線性陣列基因分型技術檢測女性尿液中人類乳頭瘤病毒

范世珍，莫 莉， 陳安彬

(深圳市福田區中醫院 檢驗科,廣東 深圳518034)

宮頸癌的細胞學篩查靈敏度低。近年來，以人乳頭瘤病毒( HPV)為基礎的初篩或聯合檢測法日益受到重視[1，2]，與細胞學檢查相比，HPV檢測可簡化樣本的收集過程，對于難以接觸的人群，可通過自行收集尿液樣本，從而為臨床篩查及疾病防治提供了條件。但迄今為止，尚沒有關于尿液以及宮頸或外陰分泌物標本中HPV檢測的比較研究[3]。本研究通過比較尿液樣本和臨床醫生收集的外生殖器(外陰)和宮頸樣本中HPV，旨在為臨床上進一步了解宮頸的疾病狀態提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得本院倫理委員會的批準。研究對象年齡18-41歲，各獲取140份尿液和宮頸分泌物標本，以及132例外陰標本。所有患者之前未行各種宮頸相關治療(如LEEP、冷刀、宮頸錐切術、冷凍療法和激光療法)。宮頸癌患者未行子宮切除術、化療或放射治療，或并發其他系統腫瘤。研究開始前簽署知情同意書。

1.2 標本獲取

患者進行盆腔檢查前，用無菌收集杯獲取第一杯尿液(含EDTA液)，后用Dacron拭子擦拭外陰尿道周圍后獲取分泌物標本。對于宮頸標本收集，窺陰器下采用Wallach broom獲取宮頸分泌物后送檢。

1.3 HPV檢測

取1 ml子宮頸或外陰標本轉移到1.5 ml微量離心管中，12 000×g離心1 min，并用1 ml Hank平衡鹽溶液(HBSS)洗滌，棄Hank液，在200 μl新鮮HBSS中重懸沉淀細胞，使用DNA血液小提試劑盒提取DNA。DNA被洗脫于100 μl的水中，取10 μl洗脫的DNA用于線性陣列測定，其他的細胞沉淀儲存于-70℃備用。對于尿液標本，采用Qiagen公司QIAamp DNA血液試劑盒提取DNA。按照試劑盒提供的步驟提取DNA用于線性陣列(Linear array)基因分型檢測HPV(Roche)。該方法可檢測HPV的37種基因型，包括13種致癌型(HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68)和24個非致癌型HPV[4]。

1.4 檢測結果分析

根據尿液、外陰、宮頸標本的線性陣列檢測結果計算致癌性HPV的總體一致性，陽性符合率和陰性符合率以及一致程度，同時，根據交叉分析法評估個別疾病分類的檢測陽性率。對病理確診宮頸上皮細胞等級2/3(CIN2/3)和CIN3，計算其敏感性、特異性、陰性、陽性預測值和Youden指數(敏感性+特異性-1)。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0處理數據，并采用χ2分析，區間估計均采用95% CI表示，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3種標本中HPV的檢出情況

140份尿液標本中，至少可檢測出1種HPV基因型。而132例外陰標本和140份宮頸標本中，分別有94份和102份至少可檢測出1種HPV。其中13種致癌性HPV基因型中至少有1種基因型分別存在于82份尿液樣本(82/140，58.6%)，96份外陰標本(96/132，72.7%) ，102份宮頸標本(102/140，72.9%)。

2.2 各種標本中HPV檢出率的一致性及相關性

宮頸分泌物和尿液共同陽性標本78例，共同陰性標本34例，宮頸分泌物陰性，尿液陽性標本4例，尿液陰性、宮頸分泌物陽性24例，致癌性HPV在尿液和宮頸樣本的一致性是80%(112/140)。外陰分泌物和尿液共同陽性標本74例，共同陰性標本36例，外陰分泌物陰性，尿液陽性標本2例，尿液陰性、外陰分泌物陽性20例，尿液與外陰樣本中的一致性為83.3%(110/132)。宮頸分泌物和外陰分泌物共同陽性標本92例，共同陰性標本28例，外陰分泌物陰性，宮頸分泌物陽性標本4例，外陰標本陽性、宮頸分泌物陰性8例，外陰和宮頸樣本中的一致性為90.9%(120/132)。尿液和宮頸標本中致癌性HPV陽性率差異有統計學意義(P=0.03)，尿液和外陰樣本間無統計學意義(P=0.40)，子宮頸和外陰樣本間無統計學意義(P=0.52)。

2.3 各臨床標本中致癌型HPV在不同宮頸病變中的檢出情況

138名婦女進行了細胞學分析。其中42例(30.4%)未見上皮內病變細胞或惡性細胞(NILM)，48例(34.8%)有未明確診斷意義的不典型鱗狀細胞(ASCUS)，20例(14.5%)有低度鱗狀上皮內病變(LSIL)，28例(20.3%)有高度鱗狀上皮內病變(HGSIL)。組織學檢查包括30個無宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)，26個CIN2和18個CIN3，因此，組織學上44/138(31.8%)為 CIN2/3 和 18/138 (13%) 為 CIN3。

2.4 不同標本中HPV的檢出率與不同組織學類型宮頸病變的關系

與組織學確診的CIN2/3相比，尿液中致癌性HPV臨床敏感度為81.8%(95% CI=69.4-92.2)，臨床特異性51.1%(95% CI=35.6-68.4)，116例外陰標本進行了組織學分析，其致癌性HPV檢出率的敏感性和特異性值分別為95.2% (95% CI=80.5-99.5) 和 40.5% (95% CI=25.8-57.5)，宮頸樣本的敏感度和特異度分別為95.5% (95% CI=81.2-99.7)和40.4% (95% CI=24.7-56.2)。各種標本中HPV的敏感性或特異性差異(如宮頸與尿液、尿液與外陰)均沒有統計學意義(P均>0.05))，宮頸和外陰樣本檢測CIN3病變敏感性為100%，然而，尿液樣本CIN3的敏感性為88.9%(表1)。

3 討論

本研究通過對尿液中HPV的檢測以及對尿液、外陰和宮頸分泌物中HPV的基因分型，與宮頸病變程度進行比較。結果顯示，不管標本為尿液、外陰還是宮頸分泌，致癌性HPV基因型在宮頸疾病級別越高，其檢出率越高。由于宮頸HPV與宮頸病變密切相關，因此，從尿液和外陰樣本對HPV的檢測，也可評估HPV誘導宮頸疾病成為可能。

表1 不同標本中HPV和宮頸病變的關系

TP：真陽性；FN：假陰性；FP：假陽性；TN：真陰性；PPV：陽性預測值；NPV：陰性預測值。

一般而言，HPV常位于子宮頸和外生殖器部位，而很少出現在尿路[3，5]。因此，尿液中檢測到HPV說明病毒從子宮頸或其他外生殖器部位繼發剝脫，本研究發現尿液、外陰和宮頸病變組織中HPV基因型高度一致。但以尿液標本中HPV比宮頸和外陰取樣中HPV的檢出率低，但特異性相對較高。大部分為CIN2/3以及CIN3的婦女能從尿液中準確檢測出HPV，這說明，檢測CIN3靈敏度高達(88.9%)可能反映有潛在宮頸疾病。當然，真實值的敏感性可能會受到一些其他因素(取樣和運輸)的影響。我們證明不同標本中HPV的基因型類似。如最常見的致癌性基因型均出現在宮頸、外陰和尿液取樣中，HPV16是最常見的基因型，但各取樣方法檢出率差異無統計學差異。此外，在這3種標本當中，陰道上皮細胞非致癌性HPV基因型檢出率相似。至于外陰或陰道HPV取樣能否準確反映宮頸HPV的基因譜，還需要更多的研究來證實。與宮頸或其他外生殖器取樣相比較，尿液取樣用于檢測致癌性HPV已經在臨床和實驗室得到了較為廣泛的研究。但于各研究當中，不同的取樣方法、儲存條件、樣品制備、DNA提取和DNA擴增均可影響HPV DNA檢測。此外，宮頸的病理學診斷目前被廣泛采用，因此通過尿液取樣檢測HPV用于臨床還有待進一步開發。

總之，以尿液為基礎的取樣可能在篩查有更高風險患宮頸疾病的婦女是一種可行的方法。特別是對于無法進行盆腔檢查患者，能減少冗繁的手工標本采集，或者需要多次重復采樣時，大大降低了勞動強度[6，7]。同時，該實驗的研究結果擴大了以尿液取樣為基礎對宮頸癌篩查有效證據，這對于流行病學研究、疾病監測、疫苗和臨床預防實驗具有重要意義。

參考文獻：

[1]Malik T,Reimer J,Gumel A,et al.The impact of an imperfect vaccine and pap cytology screening on the transmission of human papillomavirus and occurrence of associated cervical dysplasia and cancer[J].Math Biosci Eng,2013,10(4):1173.

[2]Ge S,Gong B,Cai X,et al.Prevent cervical cancer by screening with reliable human papillomavirus detection and genotyping[J].Cancer Med,2012,1(1):59.

[3]Smith GP.Filamentous fusion phage:novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science (New York,N.Y.),1985,228(4705):1315.

[4]Castle PE,Stoler MH,Wright TC Jr,et al.Performance of carcinogenic human papillomavirus (HPV) testing and HPV16 or HPV18 genotyping for cervical cancer screening of women aged 25 years and older:a subanalysis of the ATHENA study[J].Lancet Oncol,2011,12(9):880.

[5]Alameda F,Bellosillo B,Fuste P,et al.Human papillomavirus detection in urine samples:an alternative screening method[J].J Low Genit Tract Dis,2007,11(1):5.

[6]Cuschieri K,Nandwani R,McGough P,et al.Urine testing as a surveillance tool to monitor the impact of HPV immunization programs[J].J Med Virol,2011,83(11):1983.

[7]Soderlund-Strand A,Dillner J.High-throughput monitoring of human papillomavirus type distribution[J].Cancer epidemiology,biomarkers & prevention :a publication of the American.Association for Cancer Research,cosponsored by the American Society of Preventive Oncology,2013,22(2):242.