原發性膽汁性肝硬化患者外周血CD4+CD25+ Foxp3+調節性T細胞檢測及其臨床意義

許 茵，楊小娟，蒯守剛

(無錫市第五人民醫院 檢驗科，江蘇 無錫214007)

原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是好發于中年女性的慢性自身免疫性疾病[1]。在環境和遺傳因素的聯合作用下，患者免疫系統固有的特定調控機制被破壞，產生了針對肝臟的自身免疫反應[2]。而Th細胞在介導自身抗體的產生以及膽管內皮細胞的免疫功能方面發揮舉足輕重的作用[3]。CD4+CD25+調節性T細胞是一種新型的免疫抑制細胞，對自身抗原和外來抗原引起的免疫反應均有重要的調節作用，但其免疫機制目前尚未完全清楚[4]。CD4+CD25+調節性T細胞免疫負性調節作用使細胞免疫應答能力下降，最終導致疾病不斷進展甚至惡化。本文采用流式細胞儀檢測了原發性膽汁性肝硬化患者外周血中CD4+CD25+T細胞相關參數，旨在為探討CD4+CD25+T細胞是否參與PBC患者細胞免疫應答提供依據。

1 資料和方法

1.1研究對象2011年02月至2012年04月無錫市第五人民醫院住院和門診的PBC患者32例，診斷符合2000年美國肝病學會PBC診斷標準[5]，32例患者中男性3例，女性患者29例，平均年齡53.6±7.2歲。患者排除其他病毒性肝病，無輸血、酗酒、服用損傷肝臟藥物史。收集23例健康體檢者作為對照組，男3例，女20例，平均年齡50.3±6.7歲。

1.2試劑肝功能生化試劑由日本和光純藥工業提供，生化儀為奧林帕斯5400。 流式細胞儀檢測調節性T淋巴細胞的熒光標記抗體CD4-FITC抗體、CD25-PECy5抗體和Foxp3-PE抗體均購自美國BD公司；提取細胞總RNA的Trizol試劑和反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；自身抗體檢測試劑為歐蒙醫學診斷公司產品，方法為免疫印跡法；流式細胞儀：美國Beckman Coulter 3XL。PCR儀器為美國ABI-7300，瓊脂糖凝膠由北京天來公司提供。

1.3流式細胞儀檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T淋巴細胞亞群制備外周血單個核細胞(PBMC)懸液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調整細胞濃度為1×106/ml，阻斷非特異染色后加入CD4-FITC抗體和CD25-PECy5抗體各20 μl,4℃避光孵育30 min,然后進行細胞內Foxp3分子的熒光抗體染色；預冷的PBS洗滌細胞離心后加入1 ml新鮮配制的固定穿孔工作液，振蕩混勻，4℃避光孵育30-60 min；孵育后加入2 ml預配好的穿孔液避光孵育，正常血清封閉后，加入20 μl PE標記的抗人Foxp3熒光抗體,4℃避光孵育30 min,孵育結束后洗滌離心，用PBS重懸細胞沉淀上機檢測。

1.4Foxp3mRNA表達的檢測實時熒光定量PCR檢測外周血CD4+T細胞中Foxp3mRNA基因的表達。將研究對象的抗凝靜脈血分離外周血單個核細胞，采用細胞裂解方法提取外周血總RNA;用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，并用紫外分光光度儀測定其濃度；按照cDNA反應試劑盒說明書合成cDNA，以β-actin為內參照擴增的目的基因，PCR反應參數95℃5 min變性，95℃45 s，56℃1 min，72℃1 min，30個循環，72℃延伸10 min。PCR產物于2%瓊脂凝膠電泳，由成像分析系統攝片測定其分光光度計算FOXP3mRNA的表達水平。FOXP3mRNA表達量=目的基因面積分管密度值/β-actin面積積分分光密度值。

1.5統計學分析所有資料均輸入SPSS12.0軟件包，數據以均數±標準差表示，組間均數比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 32例PBC患者肝組織均存在界板炎性反應，43.75%(14/32)的患者存在肝細胞淤膽；53.13%(17/32)的患者存在匯管區纖維組織增生，假小葉生成；32例患者臨床癥狀包括乏力59.38%(19/32)；皮膚瘙癢31.25%(10/32)；肝區不適43.75%(14/32)以及食欲不振，肌肉疼痛等。體征包括黃疸56.25%(18/32)，肝、脾腫大46.88%(15/32)和43.75%(14/32)。

2.2 自身抗體與肝功能檢測結果見表1、2。

表1 32例PBC患者自身抗體檢測結果

2.3 PBC患者外周血CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞低于健康對照組，差異有統計學意義；Foxp3的mRNA水平差異無統計學意義。

表2 PBC患者與健康對照組肝功能檢測結果

表3 外周血調節性T細胞表達比較

2.4 PBC組與健康對照組比較外周血CD4+T細胞中Foxp3 mRNA的含量差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

PBC是一種免疫介導的肝臟損傷性疾病，多數患者有不同程度的肝功能異常，病理表現為肝內小膽管慢性進行性非化膿性炎性損傷為特征，導致逐漸進展為膽管阻塞膽汁淤積，引起肝纖維化，肝硬化并最終導致肝功能衰竭為特征的進行性破壞性肝病[6]。PBC常見于女性，多數患者存在高效價的自身抗體如ANA，LKM等。AMA/AMA-M2陽性是診斷PBC的重要依據(93.75%)。抗核包膜蛋白GP210和抗核點蛋白SP100對PBC有高度特異性，在AMA/AMA-M2 陰性患者中通過肝穿刺病理檢測后確診[7]。

以往研究表明，Th細胞在PBC的發病機制中發揮著至關重要的作用[8-9]，而調節性T淋巴細胞功能缺失是打破機體免疫耐受的關鍵因素[10]，CD4+CD25+Foxp3+T細胞是其主要的T淋巴細胞亞群，占外周血CD4+T淋巴細胞的5%-10%，它們表達的表面標志分子包括糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4和叉頭樣轉錄因子p3(Foxp3)，能抑制自身免疫性T淋巴細胞的增殖和功能，其中Foxp3是人調節性T淋巴細胞特異性的表面標志分子與調節性T淋巴細胞抑制功能密切相關[11]。我們對PBC患者體內Foxp3的mRNA水平進行分析，并未發現PBC組與健康對照組之間存在差異，因此我們認為在mRNA水平上不支持Foxp3的表達異常導致了PBC的耐受缺失，Lan等對PBC中調節性T細胞功能研究也并未發現這些細胞有功能缺陷，這些結果并不支持PBC患者外周血調節性T細胞產生減少或者是凋亡增加抑或存在功能缺陷。本實驗數據結果與國內外同類報道觀點接近，證實PBC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞低于健康對照組。PBC患者外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞表達低下或絕對量缺乏抑制自身反應性T淋巴細胞的增生，可能是PBC發病以及病情加重的因素之一。由此針對其免疫發病機制的調節性T淋巴細胞過繼治療逐步發展，通過體外培養增殖調節性T淋巴細胞細胞，回輸至患者發揮免疫抑制作用[12]，糾正患者體內調節性T細胞的相對平衡，將有望成為治療的新途經。

作者簡介：許菌，42歲，女，本科，主管技師，主要研究方向：生化、免疫。

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