突觸蛋白Synapsin在氧糖剝奪模型中的表達(dá)及意義

劉洪雨，莽 靖，楊 樂,胥桂華，李宗樹,王嬌琦,何金婷*，徐忠信*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

突觸蛋白(Synapsin)是反映神經(jīng)元、突觸功能狀況的內(nèi)在標(biāo)志物[1]，本研究應(yīng)用PC12細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪處理，建立缺血性腦損傷模型，采用Western blot方法檢測(cè)不同時(shí)間氧糖剝奪模型細(xì)胞中的Synapsin蛋白表達(dá)，探討Synapsin蛋白在氧糖剝奪模型中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

PC12細(xì)胞株(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)購(gòu)自北京銀紫晶生物技術(shù)公司。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自北京鼎國(guó)公司；鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗突觸素抗體購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司；Model550酶聯(lián)分析儀：美國(guó)BIO-RAD；激光共聚焦顯微鏡：日本OLYMPUS。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

PC12細(xì)胞經(jīng)NGF刺激6 d后應(yīng)用含有連二亞硫酸鈉的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，繼而繼續(xù)應(yīng)用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，并放入37℃孵箱內(nèi)的缺氧罐內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)[2]。

接種于6孔板內(nèi)的PC12細(xì)胞經(jīng)NGF(100 ng/ml)連續(xù)刺激后，分別進(jìn)行氧糖剝奪3 h，6 h， 9 h，12 h和24 h，而后消化、收集細(xì)胞，RIPA冰上裂解20 min，12 000轉(zhuǎn)/min，離心5 min，取上清液。SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，恒流1 mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5 hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，50%甲醇脫色至背景清晰，雙蒸水清洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存。用0.01M PBS洗膜，5 min×3次。加入包被液，室溫平穩(wěn)搖動(dòng)2 h。棄包被液，0.01M PBS再次洗膜，5 min×3次。一抗4℃孵育過夜，而后0.01M PBS洗膜，5 min×4次。使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋)，室溫孵育2 h。棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5 min×4次。加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng)[2-3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

培養(yǎng)3天后，PC12細(xì)胞開始停止分裂。并逐漸分化為具有交感神經(jīng)元特征的細(xì)胞，開始長(zhǎng)出神經(jīng)突起，培養(yǎng)5天后，大多數(shù)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴诮桓猩窠?jīng)元的形態(tài)，突起逐漸增多并延長(zhǎng)，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，交感神經(jīng)元樣細(xì)胞的胞體逐漸增大[4]。

2.2 MTT法檢測(cè)氧糖剝奪后細(xì)胞活力

用MTT法檢測(cè)氧糖剝奪后3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、24 h的細(xì)胞存活率，如圖1所示，隨OGD時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯下降，而OGD12 h后細(xì)胞存活率下降更明顯，OGD24 h細(xì)胞存活率為65.8%，與對(duì)照組比，差異顯著(P<0.05)。

圖1 PC12 氧糖剝奪后不同時(shí)間細(xì)胞活力

2.3 Synapsin蛋白的表達(dá)變化

應(yīng)用Western Blot檢測(cè)氧糖剝奪模型處理的PC12細(xì)胞內(nèi)Synapsin蛋白的表達(dá)，如圖2和對(duì)照組相比較，隨NGF誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，與對(duì)照組(P<0.05)，相比細(xì)胞Synapsin蛋白的表達(dá)逐漸變淺。

3 討論

缺血性腦損傷是一個(gè)復(fù)雜、多因素、多層次的病理變化過程，其中腦缺血發(fā)生后引發(fā)的一系列缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)是其根本因素。因此，針對(duì)缺血性腦損傷發(fā)生機(jī)制的研究具有重要意義。PC12細(xì)胞來(lái)源于鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(一種交感神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤)主要分泌產(chǎn)物為兒茶酚胺類遞質(zhì)包括多巴胺、去甲腎上腺素等。膜上有NGF受體，受生理水平NGF誘導(dǎo)后停止分裂，長(zhǎng)出神經(jīng)突起，分化為具有交感神經(jīng)元特性的細(xì)胞，常被用于分析神經(jīng)元分化和NGF作用分子機(jī)制的研究，也被用于研究生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)改變的機(jī)制[5]。

圖2 OGD不同時(shí)間synapsin蛋白的表達(dá)變化

氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation/OGD)是在細(xì)胞水平上模擬缺血/低氧刺激的經(jīng)典模型。通過對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)條件的改變，包括將細(xì)胞放入低氧箱或者更換無(wú)糖的培養(yǎng)基，可模擬細(xì)胞在缺血/低氧情況下的損傷，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生壞死、凋亡、自噬等現(xiàn)象[6]。本研究應(yīng)用PC12細(xì)胞模擬細(xì)胞缺血/低氧損傷后，建立氧糖剝奪模型，分別觀察OGD3 h、6 h、9 h、12 h、24 h不同時(shí)間，并采用MTT法分析細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示，隨氧糖剝奪時(shí)間增加，神經(jīng)元存活率由99.7%下降至64.3%，表明模擬缺血缺氧對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生了影響。

突觸蛋白(Synapsin)是一種與突觸相關(guān)同時(shí)具有神經(jīng)元特異性的磷酸蛋白，是一種反應(yīng)神經(jīng)元及突觸功能狀況的內(nèi)在標(biāo)志物，突觸素(Synaptophysin)可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元突起的延長(zhǎng)、參與突觸發(fā)生的過程[7]。通過磷酸化和非磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放對(duì)神經(jīng)元的早期發(fā)育和再生也起著至關(guān)重要的作用。關(guān)于腦缺血后突觸蛋白的表達(dá)變化，國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果并不一致[8]。本研究表明氧糖剝奪后突觸蛋白表達(dá)和PC12細(xì)胞活率呈正相關(guān)，Synapsin蛋白參與突觸囊泡的介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸囊泡循環(huán)，參與突觸發(fā)生[9]，研究證實(shí)，突觸蛋白是反映神經(jīng)元和突觸反映神經(jīng)元、突觸功能狀況的內(nèi)在標(biāo)志物，本研究同時(shí)采用Western Blot檢測(cè)氧糖剝奪PC12細(xì)胞內(nèi)Synapsin蛋白表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，Synapsin蛋白表達(dá)水平逐漸降低，提示神經(jīng)元缺血后隨時(shí)間變化，神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)元特性、突觸功能逐漸減低。突觸蛋白在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，并參與中樞神經(jīng)元早期發(fā)育，因此，調(diào)節(jié)腦缺血后突觸蛋白的表達(dá)可能作為診治腦缺血后病理、生理改變的一種方法，也為研究腦缺血后神經(jīng)再生和可塑性提供一種途徑。

作者簡(jiǎn)介：劉洪雨，女，在讀碩士，主要研究方向：缺血性腦損傷與保護(hù)研究。

參考文獻(xiàn)：

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