溶藻弧菌動物感染模型的建立及藥敏試驗分析

劉曉斐，張河林，胡志德，曹 源，胡成進

(濟南軍區總醫院 實驗診斷科，山東 濟南250031)

溶藻弧菌是海洋弧菌科中數量最多的革蘭氏陰性致病菌，廣泛分布于世界各地海域和口岸處，易引起海洋作業人員傷口海水浸泡感染、中耳炎、眼內炎、胃腸炎、食物中毒和敗血癥等疾病[1-4]。由于其致病特點不同于陸地致病菌，其感染規律及致病機制尚不明確，感染后表型及代謝特征復雜多變導致了臨床鑒定困難、不能及時救治等許多問題。溶藻弧菌感染主要發生在夏季，但隨著全球變暖的趨勢，溶藻弧菌感染的季節范圍逐年擴大[4]。因此，海洋溶藻弧菌越來越受到人們關注。

到目前為止，海洋溶藻弧菌感染致病機制的研究模型多局限于海洋動物，如赤鯛[5]、魚[6]、石斑魚[7]、鮑魚[8]等，而對于陸地哺乳動物感染研究較少，對于人類感染的研究僅停步在流行病學統計及病例報道，深入機制研究較少，并且可參考的動物感染模型甚少。因此，本實驗建立了溶藻弧菌腹腔注射感染昆明小鼠模型，并對感染后小鼠尾血分離株進行抗菌藥物敏感性分析，為臨床上溶藻弧菌感染治療中的合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株與實驗動物

實驗菌株：溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)菌株購自中國海洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，菌種編號 E0666。

實驗動物：SPF級雌性昆明小鼠6-8周齡，購于山東大學動物實驗中心。

1.2 半數致死量測定

實驗用健康昆明小鼠暫養2 d無異常情況后，進行腹腔注射感染。每組6只，共6組，分組飼養。細菌在含3%NaCl的堿性蛋白胨水中增菌16-20 h后收集菌懸液，將其濃度調整為4×1010、2×1010、1010、5×109、109cfu/ml，每個濃度腹腔注射菌液0.1 ml/只，對照組注射等體積無菌堿性蛋白胨水。觀察24 h，并記錄各組小鼠的死亡情況。

1.3 尾血培養

將小鼠固定在小鼠固定器上，露出尾部。將尾部放在50℃的熱水中5分鐘，待尾部充血后用干棉簽擦干，再用75%酒精棉球擦拭小鼠尾部皮膚。待酒精蒸發后，用無菌剪刀剪去尾尖0.3 cm，拭去第一滴血之后取一滴血于無菌的3.0%NaCl堿性蛋白胨水中，置于37℃恒溫搖床中145次/min過夜培養。

1.4 細菌鑒定

VITEK 2 Compact微生物自動鑒定儀(法國梅里埃公司產品)采用自動生化鑒定法，GN卡用于溶藻弧菌等革蘭氏陰性菌。每個GN測試卡有64個反應孔，其內含有干燥培養基，將調配好的標準濃度菌懸液在充填機中被里面的負壓充填到測試卡內，經封口后，放入測試槽內。讀取器每15分鐘判讀卡片一次，測定卡片內細菌在各孔培養基內生長變化值，以生長動力學方式記錄并決定結果，確保最佳報告結果時間。從平板上挑取單個菌落，用干燥無菌試管裝3 ml無菌生理鹽水在細菌比濁儀上配成0.5～0.62 MCF的菌懸液，按順序放在卡架上，取出卡片后將吸管插入到試管中并固定在卡架上，放入填充窗。然后在VITEK 2 Compact微生物自動鑒定儀上按程序自動化完成填充、封口、上卡、卸卡，取出卡架，最后輸入編號后保存。

1.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法(K-B法)，藥敏紙片為英 國 Oxiod公 司 產 品，實驗條件為：MH 平板，菌落懸液為 0.5 麥氏單位，35℃恒溫培養16-20 h，測量抑菌圈直徑大小，再根據藥敏試驗抑菌圈直徑數據和2012CLSI的M45規則判斷對各種抗菌藥物的敏感性。標準分為3個等級：敏感(S)、中度敏感(M)、耐藥(R)。敏感和中度敏感可合稱為敏感。質控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923由本科室的臨床微生物室提供。

2 結果

2.1 昆明小鼠感染后的一般情況

感染組注射溶藻弧菌菌液3 h后開始出現不同程度的毛發豎立、腹部顫抖、呼吸急促、背弓、蜷縮少動、進食減少等情況，癥狀的輕重與注射的菌量成正相關。對照組精神狀態良好，無上述癥狀，無死亡。

2.2 半數致死量(LD50)

為篩選溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠的最適菌量及感染時間，我們采用了半數致死量實驗。結果如表1所示，當腹腔感染菌量為4×109cfu時，昆明小鼠死亡率為100%，平均存活時間為13.5 h。隨著感染菌量的降低，小鼠死亡率也逐漸降低，存活時間延長。當感染菌量為109cfu時，小鼠死亡率降到50%。結果說明，溶藻弧菌E0666株感染昆明小鼠的半數致死量為109cfu，平均存活時間是20 h。

表1 溶藻弧菌E0666株腹腔注射感染昆明小鼠的半數致死量檢測

2.3 小鼠尾血細菌培養及鑒定

為確定感染效果，我們在感染后2 h從4×109組中取小鼠尾血進行血液培養，37℃恒溫搖床過夜培養后觀察，如圖1A所示,培養基渾濁，說明培養陽性。取少量培養液革蘭氏染色后在油鏡下觀察形態如圖1B所示，并經過VITEK2 Compact微生物自動鑒定儀鑒定為溶藻弧菌。結果說明，從尾血中分離出的溶藻弧菌來自于腹腔注射的溶藻弧菌，并且溶藻弧菌可以通過腹膜進入血液循環系統，導致菌血癥或敗血癥。

A:尾血液體培養 B:細菌鏡下形態

2.4 動物分離株藥敏試驗結果

為了評價溶藻弧菌對常用抗菌藥物的敏感性，我們采用了紙片法，對溶藻弧菌動物分離株做了藥敏指南上21種抗菌藥物的敏感性實驗，用精密游標卡尺準確量取藥敏紙片周圍透明抑菌環直徑的大小，根據2012版的CLSI-M45來判斷溶藻弧菌對抗生素的敏感性，三株質控菌株的藥敏結果(抑菌環直徑)都在質控范圍內。實驗結果表明，分離株對臨床常用的大多數抗生素敏感，但對氨芐西林和頭孢噻吩耐藥，見表2。

表2 溶藻弧菌動物分離株對臨床常用藥物敏感性

?R：耐藥；S：敏感

3 討論

隨著人們對海洋資源的開發和利用，海洋致病菌引起的疾病也隨之引發人們關注。溶藻弧菌對于海洋生物的危害性早已得到共識，隨著沿海地區散發臨床病例報道，其對于人類的致病性也逐漸得到認同。目前，溶藻弧菌的致病機制研究僅限于海洋動物，缺乏對陸地哺乳動物的研究，并且尚無可用于研究的哺乳動物模型。致病性弧菌屬中以霍亂、副溶血、創傷弧菌感染動物模型報道較多，多采用口服灌胃、創傷感染或腹腔注射等方式。因此，本實驗首先建立了溶藻弧菌腹腔注射感染小鼠動物模型，得到溶藻弧菌E0666菌株的半數致死量為109cfu，平均存活時間為20 h。并且通過對尾血的細菌培養及鏡下形態學觀察、VITEK2 Compact微生物自動鑒定儀鑒定后確定了模型建立成功。該模型的建立對于研究溶藻弧菌的致病機制及疫苗預防等具有重要意義，為后續建立多種感染途徑動物模型打下基礎。

目前對于溶藻弧菌的藥敏試驗研究大多取自海水或海洋生物分離培養菌株[9]，細菌的致病性及代表性不強。本實驗從感染小鼠的尾血中分離培養出動物適應株，對其抗生素敏感性進行檢測。研究發現，該菌株對于臨床上大多數抗生素敏感，但對氨芐西林和頭孢噻吩耐藥性很高。結果提示臨床應注意用藥，避免抗藥性的產生和耐藥菌株的傳播。

總之，溶藻弧菌已成為我國沿海地區散發性腹瀉和食物中毒的重要病原菌之一，對于駐島人員和海上訓練及作業人員具有潛在的致病危險。因此，開展海洋溶藻弧菌的致病機制研究和藥敏試驗研究對致病性弧菌所致疾病的防治具有重要意義。

作者簡介：劉曉斐(1984-)，女，博士，主管技師，主要研究方向為重要病原菌的致病機制研究。

參考文獻：

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