血紅素氧合酶-1介導(dǎo)金櫻子在阿霉素心肌損傷大鼠中的保護(hù)作用

羅衛(wèi)民，劉越峰，羅湘玉，張 軍*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院 心胸外科，湖北 十堰442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院)

阿霉素(Doxorubicin，DOX) 是一種廣泛應(yīng)用于腫瘤治療的蒽環(huán)類抗生素，是臨床上最有效的抗腫瘤藥物之一。盡管其對(duì)包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤具有抑制作用，但其蓄積性不可逆性心肌病以及充血性心衰限制了其使用[1]。DOX導(dǎo)致的毒性心肌病原因很多，其中活性氧(ROS)、鈣超載以及線粒體損傷介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡是其重要機(jī)制[2]。近年來，某些藥用植物在DOX所致的心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用[4]，如上調(diào)血紅素氧合酶(Heme oxygenase-1，HO-1)的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化、抗凋亡等作用。金櫻子為薔薇科金櫻子(Rosa Laevigata Michx，RLM)的果實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)它具有強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力[5,6]。本課題組的前期研究結(jié)果顯示，RLM對(duì)DOX誘發(fā)的心臟毒性具有一定的保護(hù)作用，但其機(jī)制尚未明了。本研究旨在觀察HO-1在RLM心肌保護(hù)作用中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DOX購(gòu)自意大利Pharmacia公司(批號(hào)為8NB002-A)，血清LDH和CK-MB試劑盒為Stanbio產(chǎn)品。心肌caspase-3的比色測(cè)定試劑盒購(gòu)自Quantikine。HO-1和Nrf2多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz。金櫻子購(gòu)于十堰市中草藥材公司，經(jīng)去籽后用煎藥機(jī)進(jìn)行熬煎，提取液濃度為2.0 g/ml。SnPP和其他分析純?cè)噭┲饕?gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

成年雄性Wistar大鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，體重(250±5)g，在SPF環(huán)境下給予標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的水和食物飼養(yǎng)2周。大鼠隨機(jī)分成4組(每組15只)，如下：組1：對(duì)照組(15只)，大鼠接受等體積的生理鹽水作為陰性對(duì)照；組2： DOX組：大鼠連續(xù)兩周每間隔48h注射DOX(2.5 mg/kg,i.p.) 共6次，使其累積劑量達(dá)15 mg/kg。組3：DOX 治療組：在組2的基礎(chǔ)上，大鼠每日給予RLM(5 g/kg)灌胃，DOX停止后，持續(xù)RLM灌胃4周。組4：SnPP干預(yù)組：在組3基礎(chǔ)上，給予20 μmol/kg SnPP腹腔注射，每周3次，持續(xù)時(shí)間同組3。

1.3 血清CK和LDH活性的測(cè)定

采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)340 nm處測(cè)量CK-MB的吸光度。LDH的測(cè)量按照南京建成生物工程研究所產(chǎn)品提供的診斷試劑盒進(jìn)行，計(jì)算血清總LDH的活性(U/L)。

1.4 心肌HO-1活性測(cè)定

將獲取的心肌組織勻漿18 000×g 4℃離心10 min，獲取400 μl上清加到反應(yīng)混合物中(含0.8 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡糖糖-6-磷酸鹽、0.2U葡糖糖-6-磷酸鹽-1脫氫酶、2 mg大鼠肝臟胞漿、100 mmol/L PBS以及10 μmol/L氯化血紅素)。反應(yīng)在黑暗的環(huán)境中37℃孵育1h后加入1 ml氯仿終止反應(yīng)。并在463 nm和530 nm雙波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(膽紅素吸光系數(shù)為40)，以生成的膽紅素量表示HO-1活性，單位為nmol/(mg protein.h)，并計(jì)算其與對(duì)照組的相對(duì)值。

1.5 caspase-3活性測(cè)定

50 mg心肌組織加入0.8 ml pH7.4的裂解緩沖液中制成勻漿。10 000 g 4℃離心15 min。獲取上清用于caspase-3測(cè)定。采用間接法測(cè)定caspase-3活性，基于caspase-3切除底物分子DEVD-pNA中的發(fā)光基團(tuán)pNA，隨后在405nm處測(cè)量其吸光度，從而間接反應(yīng)其活性。

1.6 Western blot檢測(cè)HO-1表達(dá)以及Nrf2核轉(zhuǎn)位

根據(jù)試劑盒(Pierce)提供的步驟提取心肌組織中的總蛋白和核蛋白，并測(cè)定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(Millipore)，并利用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 g·L-1脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入抗HO-1(1∶500)、β-actin(1∶5 000)、抗Nrf2(1∶1 000)，抗TBP(1∶1 000)的抗體4℃孵育過夜。多次洗滌之后，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000 稀釋)孵育膜1 h。ECL法(Amersham)發(fā)光、顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RLM對(duì)血清CK-MB和LDH水平的影響

與正常組相比，DOX可導(dǎo)致血清LDH和CK-MB增高(P<0.01)，與DOX處理組相比， RLM可導(dǎo)致血清LDH和CK-MB水平顯著降低(表1)，而SnPP處理組中LDH和CK-MB水平明顯高于RLM組(P<0.05)，但與DOX組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 RLM對(duì)血清CK-MB和LDH水平的影響

aP<0.05 VS 對(duì)照組；bP<0.05 VS DOX 組；cP>0.05 VS DOX組

2.2 RLM對(duì)心肌HO-1活性的影響

DOX處理后，與對(duì)照組大鼠相比，心肌組織中HO-1酶活性輕微增高。而經(jīng)5 g/kg RLM處理后，HO-1酶活性顯著增高。而同時(shí)用SnPP處理后，HO-1酶活性明顯低于RLM組，但仍高于對(duì)照組，見圖1。

1.陰性對(duì)照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP *P<0.05 VS 對(duì)照組；#P<0.01 VS DOX 組；△P>0.05 VS DOX組

2.3 RLM抑制caspase-3活性

DOX處理后，心肌組織中caspase-3活性增加了55%。同時(shí)經(jīng)5 g/kg RLM處理后，caspase-3活性有所降低，而SnPP處理能再次上調(diào)caspase-3的活性，見圖2。

1.陰性對(duì)照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP *P<0.05 VS 對(duì)照組；#P<0.01 VS DOX 組；△P>0.05 VS DOX組

2.4 RLM對(duì)心肌組織中HO-1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，DOX大鼠心肌組織中HO-1蛋白表達(dá)水平有輕微增高，而經(jīng)RLM處理后，HO-1表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)(圖3)。SnPP處理能再次降低HO-1的表達(dá)。而內(nèi)參β-actin含量保持一致。

1.陰性對(duì)照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP

2.5 RLM對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2活化的影響

Western blot結(jié)果顯示，DOX大鼠心肌組織內(nèi)細(xì)胞核中Nrf2含量與對(duì)照組相比增高不明顯，而RLM處理后，Nrf2轉(zhuǎn)位水平顯著增多，表明RLM能促進(jìn)Nrf2從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中(圖4)。

1.陰性對(duì)照；2.DOX模型組；3.DOX+5 g/kg RLM；4.DOX+5 g/kg RLM+SnPP

3 討論

DOX是一種作用于DNA的蒽環(huán)類抗生素，它能夠?qū)NA發(fā)生嵌入作用，在臨床中應(yīng)用廣泛。阿霉素的急性副作用包括惡心、嘔吐和心律不整。長(zhǎng)期使用后，在線粒體氧化磷酸化作用下，阿霉素和鐵相互作用產(chǎn)生大量活性氧，可以破壞心肌，造成肌原纖維損傷或凋亡。HO-1是催化血紅素降解為CO、亞鐵離子和膽紅素的限速酶，并在機(jī)體的抗炎癥、抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用[4]，本研究顯示，DOX毒性大鼠經(jīng)RLM處理后，可顯著上調(diào)HO-1的酶活性以及其蛋白表達(dá)。HO-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的結(jié)合位點(diǎn)，本研究也證實(shí)RLM能誘導(dǎo)Nrf2從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，從而激活Nrf2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。

Nrf2是機(jī)體一種重要的獲得性保護(hù)性核轉(zhuǎn)錄因子。在非激活情況下，Nrf2通過與抑制物keap1結(jié)合于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到外源性刺激時(shí)，Nrf2從keap1中分離出來，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，從而與應(yīng)激誘導(dǎo)性基因包括HO-1的啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化劑應(yīng)答元件結(jié)合[5]。本研究發(fā)現(xiàn)RLM處理后，Nrf2轉(zhuǎn)位增加，這與心肌組織中HO-1蛋白表達(dá)以及酶活性的趨勢(shì)一致，表明RLM誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)可能是由于Nrf2的活化所致。HO-1的代謝產(chǎn)物如CO和膽綠素在多種肺部疾病包括ALI中發(fā)揮抗氧化和抗炎癥作用，包括抑制促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、ROS形成[6]。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)HO-1在RLM的保護(hù)效應(yīng)中的作用，在干預(yù)過程中加入SnPP，對(duì)RLM的保護(hù)作用進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，DOX模型大鼠血清LDH和CK-MB顯著增高，而經(jīng)RLM處理后，這些心肌損傷指標(biāo)顯著降低。同時(shí)給予SnPP處理后，能顯著逆轉(zhuǎn)RLM的保護(hù)效應(yīng)。這表明RLM是通過上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)并上調(diào)其酶活性，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

DOX致心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制很多，包括離子和自由基假說、代謝機(jī)制和凋亡機(jī)制。心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，多種抗腫瘤藥物可引起其壞死或凋亡，從而引起心肌細(xì)胞減少而導(dǎo)致心臟收縮功能不足。研究顯示，DOX可通過內(nèi)源性和外源性機(jī)制引起心肌細(xì)胞凋亡，最終激活下游caspase-3，6和7。一旦caspase被激活，細(xì)胞即進(jìn)入凋亡執(zhí)行階段。本研究發(fā)現(xiàn)，RLM可抑制DOX引發(fā)的caspase-3激活，而HO-1抑制劑SnPP處理后，caspase-3活性再次增高，這表明HO-1能在一定程度上削弱DOX的促凋亡效應(yīng)，最終抑制DOX引起的心肌細(xì)胞凋亡、壞死及心肌纖維化。

綜上所述，本研究認(rèn)為RLM可以促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)心肌組織內(nèi)HO-1表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)其酶活性，進(jìn)而通過HO-1對(duì)DOX導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制作用。

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