電離輻射對昆明大鼠背部全厚皮瓣leptin表達影響的研究

陳一夫，王博蔚，張環(huán)環(huán)，劉志輝，劉春麗

(1.吉林大學口腔醫(yī)院，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫(yī)院 婦產科，吉林 長春130041)

Leptin既是脂肪細胞分泌的多效細胞因子，也是一種分泌型的蛋白質類激素，可以通過受體介導的信號途徑發(fā)揮作用，也可通過自分泌和旁分泌方式直接作用于周圍的組織器官發(fā)揮作用[1-3]。近年來leptin的研究熱點是其對傷口促愈作用機制的研究，開放性傷口單獨外用leptin能明顯縮短傷口愈合時間(從原來的5-7 d縮短到3-4 d)。其主要機制為：參與傷口愈合早期的炎癥反應；刺激內皮細胞分泌血管緊張素Ⅱ，促進愈合早期的血管收縮；促進Ⅰ膠原和Ⅱ膠原的合成；促進血管內皮細胞的增殖，刺激微血管形成，促進血管再生；促進角化細胞的有絲分裂，促進上皮愈合；誘導血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF)-β1和纖維生長因子(FGF)-β等致轉移因子的釋放，通過細胞因子之間的相互作用促進傷口愈合[4-9]。

Leptin能促進單純傷口加速愈合，但其對于放創(chuàng)復合傷的愈合是否具有促進作用目前尚未知。本研究在于揭示放創(chuàng)復合傷對皮瓣組織內leptin的表達影響，從而為運用leptin治療放創(chuàng)復合傷愈合的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明小鼠(購自吉林大學動物實驗中心)，leptin兔抗小鼠多克隆抗體、leptin長型受體(Ob-Rb)兔抗小鼠多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，PV-9001免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋有限公司)，復合消化液、抗原修復液(武漢博士德公司)，DAB顯色試劑盒 及DAB染色增強劑(中杉金橋有限公司)，0.01M的PBS(北京鼎國生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 放創(chuàng)復合傷動物模型的建立 昆明小鼠，雄性，標準飼養(yǎng)一周后，用隨機數字表隨機分為4組：空白對照組(D)，創(chuàng)傷組(C)，放射組(F)，放射+創(chuàng)傷組(放創(chuàng)組)(FC)每組24只。水合氯醛腹腔注射麻醉，小鼠背部去毛，將(C)、(FC)組小鼠俯臥于手術臺上，碘伏消毒，鋪無菌巾，設計2.5 cm×2.0 cm全厚隨意皮瓣，游離端位于髂棘之上1 cm，蒂設計在尾端，創(chuàng)緣各距背部中線兩側0.5 cm，眼科剪沿劃線區(qū)剪開預備全厚皮瓣，沿創(chuàng)緣原位對位縫合創(chuàng)口。術后3天F及FC組采用電子線對小鼠進行局部照射，照射野為矩形，大小為3.5 cm×3.0 cm，照射野外圍比較皮瓣面積外圍均大出0.5 cm。采用瓦里安的電子直線加速器，電子線照射，5Gy。對實驗小鼠每日進行大體觀察，分別于放射后1 d，2 d，3 d處死各組小鼠8只，于皮瓣中軸線上距離蒂部1.5 cm，左右距中軸線0.5 cm處取隨意皮瓣(面積為1.0 cm×1.0 cm)，立即投入4%的多聚甲醛固定常規(guī)脫水包埋，進行HE染色及免疫組化。

1.2.2 檢測指標 (1)大體觀察。 (2)HE染色，組織學觀察。(3)免疫組化染色：石蠟切片進行常規(guī)脫蠟水化，對組織切片進行Leptin、Ob-Rb免疫組化的染色，操作步驟按照PV-9001免疫組化檢測試劑盒所提供的進行。

2 結果

2.1 大體觀察

(1)創(chuàng)口愈合情況：

各組皮瓣無潰瘍壞死情況。同一時間，放創(chuàng)組的滲出較單純創(chuàng)傷多，結痂面積較單純創(chuàng)傷組大，皮膚質地較單純創(chuàng)傷組硬。傷口愈合時間比較：單純創(chuàng)傷組創(chuàng)口愈合時間大約為4 d-8 d，平均6 d；放創(chuàng)組為9 d-24 d，平均14 d。

(2)毛發(fā)再生情況(見圖1)

毛發(fā)開始再生時間：空白組：1 d-2 d，平均1 d；單純創(chuàng)傷組為2 d-5 d，平均3 d，單純照射組為：6 d-32 d，平均均為8 d，放創(chuàng)組：9 d-30 d，平均12 d。

毛發(fā)完全恢復時間：空白對照組：2 d-5 d，平均4 d；單純創(chuàng)傷組為7 d-14 d，平均9 d；單純照射組為：12 d-40 d，平均18 d，放創(chuàng)組：12 d-40 d，平均25 d。

圖1 毛發(fā)生長時間比較

2.2 組織病理學檢查

單創(chuàng)組可見創(chuàng)傷后0 d-5 d大量炎癥細胞浸潤和創(chuàng)緣出血，隨時間延長，炎癥細胞數量減少，肉芽組織增生，上皮延伸，創(chuàng)口愈合。放創(chuàng)組可見：上皮層內細胞出現空泡化現象；有的上皮細胞出現異型性改變和基底膜消失；照射后3 d-7 d內，上皮釘突延長；7 d后上皮釘突變短或消失；傷口愈合后，上皮變薄，膠原纖維稀疏切排列紊亂。放射組：間質中可見少量炎性細胞浸潤，主要是單核細胞，膠原纖維變性萎縮，玻璃樣變，整個上皮層變薄(見圖2)。

圖2 放創(chuàng)組組織病理學變化

2.3 免疫組化結果

(1) 免疫組化觀察：

Leptin在角化上皮細胞及毛囊根鞘中呈強陽性表達，在基底膜和成纖維細胞中呈弱陽性表達，在皮脂腺的混合性腺泡的漿液細胞呈強陽性表達。Ob-Rb在細胞團的外層角化細胞及上皮棘層細胞的細胞間橋中呈強陽性表達，在毛囊的根鞘的內外根鞘均呈強陽性表達，血管內皮細胞弱陽性表達，在皮脂腺的漿液性腺泡呈強陽性表達，粘液性腺泡不表達(見圖3、4)。

圖3 leptin在不同部位的表達情況

圖4 OB-Rb在皮膚不同部位的表達

(2) 各組間leptin及OB-Rb表達的差異性比較：免疫組化灰度積分統(tǒng)計表明，電離輻射后早期(1-3天)，放創(chuàng)組leptin及其受體的表達明顯增強，其表達量高于單純創(chuàng)傷組、單純放射組及對照組；而單純創(chuàng)傷組的表達量明顯強于單純放射組及對照組；單純放射組強于對照組(見表1、表2)。

表1 各組間leptin表達的比較

放射后第1、2、3天組間兩兩比較leptin的灰度積分，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。創(chuàng)傷組，放射組，放創(chuàng)組各組內進行l(wèi)eptin灰度積分統(tǒng)計，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

表2 各組間OB-Rb表達的比較

放射后第1、2、3天組間兩兩比較OB-Rb的灰度積分，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。創(chuàng)傷組，放射組，放創(chuàng)組各組內進行OB-Rb灰度積分統(tǒng)計，P<0.05具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

本研究發(fā)現黏液性腺泡細胞和肌上皮細胞對放射線不敏感，若損傷長期存在，漿液性腺泡細胞萎縮、消失，導管擴張，導管上皮出現鱗狀細胞化生，間質纖維化，炎癥細胞浸潤和脂肪組織增生。真皮間質膠原呈不同程度水腫，膠原斷裂，少量淋巴細胞浸潤，膠原纖維裂解，出現玻璃樣變，彈力纖維增多。據此我們推測漿液性腺泡是電離輻射的靶細胞。

有學者發(fā)現在皮膚創(chuàng)傷后早期OB-Rb表達量降低，第5天起表達水平迅速上調。免疫組化在位于傷口邊緣表皮內角化細胞中檢測到高表達的OB-Rb，體外實驗也證實外源性的Leptin可顯著促進小鼠或人原代角化細胞的增殖，而這種刺激效應能夠被一種可溶性的無功能leptin受體所阻斷[10]。本研究發(fā)現，無論是單創(chuàng)組、單純放射組，還是放創(chuàng)組，在早期leptin及其受體的表達都顯著上升，尤以放創(chuàng)組更為顯著，這提示放創(chuàng)復合傷愈合早期，leptin以旁分泌或自分泌的方式參與創(chuàng)傷愈合。

本研究發(fā)現：在放創(chuàng)復合傷局部，Leptin在角化上皮細胞及毛囊根鞘中呈強陽性表達，在基底膜和成纖維細胞中呈弱陽性表達，在皮脂腺的混合性腺泡的漿液細胞呈強陽性表達。Ob-Rb在細胞團的外層角化細胞及上皮棘層細胞的細胞間橋中呈強陽性表達，在毛囊的根鞘的內外根鞘均呈強陽性表達，血管內皮細胞弱陽性表達，在皮脂腺的漿液性腺泡呈強陽性表達，粘液性腺泡不表達。該結果提示leptin可能參與調控毛囊的形態(tài)發(fā)生，且毛囊根鞘很可能是電離輻射作用的靶器官，電離輻射會導致毛囊根鞘的損傷，因此影響毛發(fā)再生，這與本研究結論完全相符，雖然電離輻射導致毛囊根鞘局部反饋性調節(jié)致使leptin及其受體表達顯著提高，用以加速局部的創(chuàng)傷愈合，但是仍不足以彌補電離輻射所致毛囊根鞘局部創(chuàng)傷修復細胞的受損，因此會導致毛發(fā)再生延遲或減少。這與某些學者的研究結論相符，諸如毛囊等上皮結構的發(fā)生可能依賴于leptin的信號傳遞，后者通過激活細胞內的信號級聯系統(tǒng)復合物的磷酸化完成[11-12]。

綜上所述，電離輻射會導致放創(chuàng)復合傷局部早期Leptin及其受體的表達明顯升高，尤以漿液性腺泡細胞及毛囊根鞘顯著，提示漿液性腺泡細胞及毛囊根鞘作為電離輻射的靶細胞參與了放創(chuàng)復合傷的早期愈合，通過正反饋調節(jié)作用分泌Leptin促進放創(chuàng)復合傷愈合。

作者簡介：陳一夫(1993-)，男，本科學歷，研究方向：口腔頜面部創(chuàng)傷修復與重建。

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