自發性高血壓大鼠血液miRNAs表達分析

鞠傳靜，王旭渤,梁斌斌，李 穎,于 冰

(1.一汽總醫院 心內科，吉林 長春130011；2.邯鄲鋼鐵有限責任公司職工醫院；3.解放軍95810部隊衛生隊)

高血壓病是一種危害人類健康的常見病和多發病，容易引起冠心病、腦卒中等一系列心腦血管疾病。隨著社會老齡化的加劇、人們生活水平的提高、生活節奏的加快以及飲食結構的改變，高血壓病發病率持續上升，并呈現出年輕化的趨勢[1]。該病及其并發癥的預防、治療已廣泛受到醫學界和科學界的關注。世界各國均十分重視高血壓病發病機理以及臨床防治的研究。高血壓病是我國居民健康的主要威脅，目前全國高血壓患者已達2億人。雖然高血壓病被確定為心血管疾病的重要危險因素已近50年，但如何預防及有效控制依然是世界性難題，其主要障礙是 95% 以上的高血壓為病因不明的原發性高血壓，因此難以進行有效的早期預防和治療[2,3]。

microRNA (miRNA)是一類長約18-25nt的單鏈非編碼小RNA，主要通過結合于靶基因的3'非翻譯區抑制靶基因的翻譯或導致mRNA降解，從而抑制靶基因的表達。miRNA 在許多生物學過程中發揮重要的調控作用，如細胞增殖、分化、凋亡、癌癥發生等。最近研究表明，miRNA 也參與調控心血管系統的發育和疾病發生過程。深入理解miRNA調控高血壓病的機制，不僅有利于闡明高血壓病發病的分子機制，而且有利于制定更好的治療策略。

本課題組前期對SHR大鼠和正常大鼠血液進行miRNA差異表達分析(miRNA芯片)，在此研究基礎上篩選出差異表達顯著的miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*進一步分析研究，將為人類高血壓診斷及治療研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SPF級自發性高血壓大鼠(合格證號：SCXK(京)2012-0027) 北京維通利華公司，質量(200±20) g，10只，12周齡。實驗期間以常規大鼠飼料飼養，自由飲用自來水，并適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，DEPC購于美國Sigma公司，TSYBR Premix Ex TaqTM ‖(Perfect Real Time)購于日本TaKaRa公司，PrimeScript RT reagent Kit購于日本TaKaRa公司，7300熒光定量PCR儀購于美國ABI公司。

1.3 引物設計

根據miRBase數據庫,分別設計檢測鼠源miR-448-5p、miR-128、miR-146a、miR-24-2*及對照U6的引物，引物序列見表1。

1.4 RNA 的提取

每只大鼠尾靜脈采集血液250 μl，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理水溶解RNA。檢測總RNA溶液260 nm及280 nm處的吸光度值，計算總RNA濃度和純度，吸光度比值>1.8可用于檢測。

1.5 miRNA特異性反轉錄

參照PrimeScript RT reagent Kit 試劑盒說明操作合成cDNA：5×primer script buffer 4 μl，Enzymix 反轉錄酶1 μl，RT反轉錄引物0.5 μl，RNA 2 μg，加水(無RNA酶) 補至20 μl體系；反應條件為:42℃溫育30 min， 85℃ 5 min 滅活逆轉錄酶，4℃保存備用。

1.6 熒光定量PCR(qRT-PCR)

實時熒光定量PCR，20 μl反應體系:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，模板cDNA 2 μl，上下游引物(10 μM) 各0.5 μl，雙蒸水定容至20 μl。采用已經優化好的條件進行實時定量PCR檢測。反應結束后,軟件系統自動得出熔解曲線，分析相對表達量，得到RQ值，引物如表1(U6作為內源性對照)。

1.7 統計學分析

采用SPSS16.0軟件進行統計分析所有數據，結果采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 miRNA-448等4種miRNA的RT引物和qPCR引物序列

2 結果

2.1 RNA質檢結果

采用紫外吸收測定法測定提取的大鼠血液總RNA純度及濃度，結果顯示，所有樣本的D260nm/D280nm均為1.8-2.0之間，說明RNA提取的質量好，基本上無蛋白質、核酸的污染，可以用于后續實驗。

2.2 熒光定量PCR的條件優化及特異性

miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*的實時定量PCR反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性10 s、65℃退火43 s，共45個循環，重復3次取平均值。結果如圖1、2，無非特異性的擴增產物條帶，熔解曲線圖只有一個產物熔解峰，Tm值為80.25℃。

2.3 熒光定量PCR標準曲線的分析

miR-448-5p和U6 RNA的相關系數R2均大于0.98,并在10-3-10-7范圍內以10倍倍比稀釋這樣一大跨度范圍內DNA的拷貝數與循環域值(Ct)之間存在著良好的線性關系，說明該檢測樣品具有非常好的可重復性。miR-448-5p和U6的擴增效率非常接近,滿足比較閾值法的前提條件,可以進行相對定量(圖3、4)。

圖1 miRNA-448-5p和U6的擴增曲線 圖2 miRNA-448-5p的熔解曲線 圖3 miRNA-448-5p熒光定量PCR標準曲線 圖4 U6熒光定量PCR標準曲線

2.4 SHR大鼠血液中miRNA-448-5p等4種miRNA熒光定量PCR

結果顯示，SHR大鼠血液中miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*表達水平均上調2倍以上，且差異極顯著(與對照組相比，P<0.01，見圖5)，實驗結果與前期SHR大鼠血液miRNA芯片結果一致。

*表達分析注：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

miRNAs是一類自然形成的非編碼RNA,人們已經發現了700多種miRNAs[4]，其中不少miRNAs分子已經被證實與多種疾病的發生有關,miRNAs研究的發展使其能夠作為各種疾病的生物學標志物。Wang等發現miR-208a在正常人血液中不表達，而心肌梗死患者血清中表達，具有特異性及敏感性，可作為心肌梗死診療的一種生物標志物[5]。本文結果顯示高血壓組miR-448-5p、miR-128、miR-146a和miR-24-2*表達均上調，與對照組比較差異顯著，有統計學意義(P<0.001)。何鳳屏等發現原發性高血壓并發心肌缺血患者miRNA-21等miRNA上調[6]，于麗萍研究原發性高血壓的let-7e等miRNA上調[7]，這些上調的miRNA作為高血壓病診斷標志物，有待于人們進一步研究確證。血液中miRNAs的水平和活性變化參與心血管疾病的病理過程，在檢測中具有獨特優勢，在心血管疾病的診斷及治療中具有非常重要的意義。

miRNAs有莖環RT-PCR方法(stem-loop RT-PCR)[8](本研究主要采用此方法)、poly( A)加尾RT-PCR 方法[9]及Northern印跡法、小RNA芯片法、深度測序法等方法[10-14]。隨著這些技術的不斷優化、成熟，miRNA 檢測變得更容易、快捷和便宜，

為它在臨床疾病診斷中的應用奠定基礎。

血液miRNA作為分子標志物將改變和補充對高血壓發生發展的傳統認識，提供高血壓診斷和治療新的生物標志物。隨著血液miRNA檢測方法的標準化，以及對血液miRNA的生成機制、生物學功能和與相關高血壓關系的逐步闡明，可以相信血液miRNA在未來的臨床診斷和預后中將展示出廣闊的臨床應用前景。

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