深圳市婦女宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16型E6、E7致癌基因的序列分析

關嵩青,林 莉,葉 菲

(深圳市第二人民醫(yī)院 婦科，廣東 深圳518035)

近年來眾多各國學者對宮頸癌的病因以及宮頸鱗狀上皮細胞發(fā)生癌變機制的分子流行病學研究資料表明，99.7%的宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展過程與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)，特別是與高危型人乳頭瘤病毒(High-risk HPV,HR-HPV)的持續(xù)感染密切相關[1]，是宮頸癌的主要致癌因素。在目前所有已知的HR-HPV亞型中,感染率最高的是 HPV16型,約占58%。據(jù)文獻報道,與其他的HPV亞型相比,HPV16 型更容易在宮頸鱗狀上皮細胞內長期復制生存[2]，引起宮頸鱗狀上皮內瘤樣病變(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)[3]的可能性更大，它是通過致癌基因E6的原癌蛋白與p53相互作用,形成新的蛋白復合物,使p53降解、功能減弱甚至喪失,破壞p53介導的細胞對DNA 損傷的免疫應答，導致細胞周期紊亂,不斷加重DNA 損傷,最終引起癌變[4]；另一方面通過致癌基因E7的原癌蛋白與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(pRb)結合，激活細胞周期,引起組織細胞增殖[5]。由此可見，HR -HPV E6、E7基因都是早期致癌基因，它們二者在宮頸上皮細胞的表達在其癌變發(fā)生過程和維持惡變細胞惡性表型兩方面都起著極其重要的作用。

為了解深圳市宮頸癌患者癌組織中HPV16型E6、E7致癌基因的結構特點,本研究對我院1 例在深圳市居住了17年、HPV16型感染的宮頸癌患者的手術標本進行了HPV16型 E6、E7致癌基因克隆及一級結構分析，探討深圳市HPV16型地方株與德國標準株 E6、E7基因核苷酸序列的差異。

1 材料和方法

1.1 標本來源

來源于深圳市第二人民醫(yī)院宮頸癌手術切除組織標本,組織病理診斷為宮頸鱗狀細胞癌，按FIGO 分期為Ⅱb期,特異性PCR 分型確定為HPV16 型陽性。該患者40歲，至發(fā)病止在深圳居住生活17年。

1.2 HPV16型E6基因檢測

1.2.1 設計、合成PCR引物 設計HPV PCR L1基因引物和HPV16型E6基因引物是參考GenBank的德國標準株中的序列，自行設計，引物序列如下：MY09:5′-GCCTMCRAGRAGAWTCAGCT-3′；MY11:5′-CGCMGAGGCWTAAAAYTAGG-3′；HPV16 E6上游:5′-AGTAGCTGCGTAAGAAATGA-3′；HPV16 E6下游:5′-TTTGTTACGGTTCGGATAC-3′。

1.2.2 PCR 擴增HPV16型 E6基因及HPV L1基因 提取本例宮頸癌患者手術切除標本癌細胞中的DNA，作為樣板，在高保真Taq酶的作用下PCR擴增HPV L1基因，將PCR擴增所得產物2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳所測得的序列與Blast序列比對分型，挑選出HPV16型標本，再用HPV16型E6基因引物對其PCR擴增，挑選在500 bp附近處出現(xiàn)DNA帶的標本，最后予以純化。

1.2.3 檢測序列 把前述已提純的PCR產物在DNA自動序列分析儀(AB I3730型)上通過MY11、MY09引物的作用，用PCR直接測序法，對目標基因的正負雙鏈從正反雙方向同時測序，對突變標本則重新PCR擴增，反復測序，旨在防止PCR擴增過程產生的誤差，導致實驗數(shù)據(jù)不精確。應用同樣方法對HPV16 E6基因的目標基因正、負鏈從正、反雙方向予以測序。

1.2.4 HPV 16型 E6基因多態(tài)性分析 以Blast序列與前述測出的序列進行比對分型，應用DNAstar5.0和MEGA3.1軟件分析HPV16型E6基因的多態(tài)性。

1.3 HPV16型 E7 基因測定

1.3.1 質粒和宿主菌 在Promega公司購買pGEM-Teasy載體，采用揚州大學比較醫(yī)學中心提供宿主菌DH5α。

1.3.2 試劑 常規(guī)的分子生物學試劑如異丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)、限制性內切酶、Taq聚合酶等上海生物工程公司購買，在大連寶生物公司購買DNA Marker和T4DNA連接系統(tǒng)，在QIAgen公司購買凝膠回收試劑盒和DNA提取試劑盒

1.3.3 癌組織DNA提取 嚴格按照DNA提取試劑盒上的說明書進行，采用標準的酚、氯仿方法提取宮頸癌標本組織中的DNA。

1.3.4 擴增HPV16型E7基因 (1)設計特異性引物：以GenBank收錄的德國標準株全序列DNA為樣板，做適當調整后，自行設計包含HPV16型E7基因完整閱讀框(562-858)在內的特異性引物：下游引物：5′-GGAAGCTTTTATGGTTTCTGAGAAC-3′；上游引物：5′-GCGAATTCATCATGCATGGAGATACACC-3′；同時在上游引物5′端設計了EcoRI酶切位點，在下游引物5′端設計了HandIII酶切位點。

(2)以宮頸癌組織標本癌細胞中提取的DNA作為模板，用PCR法在HPV16型的特異性引物的作用下進行型別鑒定，之后用E7基因的特異性引物PCR擴增HPV16型E7基因。擴增參數(shù)定為：94℃5 min，94℃40 s，57℃1 min，72℃1 min，四個步驟循環(huán)30次，最后一次循環(huán)72℃延伸6 min。

1.3.5 克隆HPV16型E7基因 對經(jīng)PCR擴增所得產物用1%瓊脂糖凝膠電泳找到E7擴增帶，把相應的凝膠片段用凝膠回收試劑盒回收，將目標片段與載體pGEM-Teasy連接，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)過藍白斑篩選，最后用HandIII、EcoRI雙切酶進行酶切鑒定。

1.3.6 測定HPV16型E7基因的序列 由上海生工生物工程公司對HPV16型E7基因的序列進行測定。運用DNAStar軟件分析所測得的E7基因序列。

2 結果

2.1 PCR擴增HPV16 型E6、E7基因的結果

以本例宮頸癌患者手術切除標本癌細胞中的DNA 為樣板,在高保真Taq酶的作用下，PCR法擴增HPV L1基因，將PCR擴增產物2%瓊脂糖凝膠電泳,在約500 bp 處清晰可見到一特異的條帶(圖1),與預計片斷大小一致。

2.2 HPV16型 E6、E7基因重組質粒的構建

將PCR 擴增所得產物回收后，連接線性克隆載體pGEM-Teasy,構建成了HPV16 E6E7 2p GEM-Teasy重組質粒。之后將前述的重組質粒經(jīng)轉化，以及Hand Ⅲ和EcoRI雙酶切鑒定后，進行陽性克隆篩選。結果酶切電泳顯示預計的片段與重組質粒的插入片段大小一致(圖2)。

圖1 HPV16 E6E7基因的PCR擴增結果

圖2 HPV16 E6E7重組質粒

2.3 HPV16型 E6、E7 基因序列測定及分析

由上海生工生物工程技術服務有限公司將插入的重組質粒用T3、T7通用引物從正、反兩個方向測序,測序得深圳地方株HPV16型 E6、E7基因序列。用DNAStar軟件比較GenBank收錄的德國標準株HPV16型E6、E7基因序列和本研究中測序克隆所得的HPV16型 E6、E7 基因序列,結果表明德國標準株HPV16 型E6、E7基因序列與本研究中克隆的HPV16型 E6、E7 基因序列完全相同。

3 討論

多項研究資料表明高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)是一種嗜組織鱗狀上皮細胞DNA的無包膜病毒,其基因組約長8 kb,呈雙鏈高度螺旋化的環(huán)狀結構,包含3個功能區(qū)：長控制區(qū)(long control region,LCR)、早期基因區(qū)( E 區(qū))和晚期基因區(qū)(L 區(qū))。其中早期轉錄區(qū)基因組長約4 500 bp,包含6個開放讀碼結構(ORF),它們分別編碼E1 、E2-E7 6 個早期蛋白,共同參與病毒DNA的轉錄、復制、細胞轉化、翻譯和調控等過程。其中HPV16型 E6 基因組全長包含477 個核苷酸,從83 位到559 位,分別對151 個氨基酸殘基的病毒原癌蛋白進行編碼。E6基因與p53的相互作用是E6 基因的致癌關鍵，它可引起p53 降解、功能減弱甚至喪失,使其減弱或喪失對細胞增殖周期中多個相關因子，如Cyclins、p21、Cdks、PCNA 等因子的調節(jié)作用,不斷加重了細胞中DNA 受損，最終導致細胞癌變[4]。E7基因組全長包含297個核苷酸,從562 位到858 位,分別對98 個氨基酸殘基的病毒原癌蛋白進行編碼,該基因組是病毒的主要轉化基因,它編碼了病毒的E7 蛋白，后者是含有“Cys2X2X2Cys”鋅指結構的細胞DNA結合蛋白。E7 蛋白的C 端有2 個鋅指結構,N 端有37個氨基酸，是E7蛋白的活性轉化區(qū),其結構與SV40 T和腺病毒E1 A 抗原的結構類似,能與抑癌基因蛋白Rb、P53等相結合,干擾后者的抑癌功能,可導致機體細胞惡性轉化、永生化以及使細胞維持惡性的表型[6]。Song等[7]認為,在 HR -HPV致癌過程中,在癌產生的早期E7基因主要導致細胞轉形,在癌產生的后期E6基因主要引起細胞惡化。

眾多研究人員在不同地區(qū)和國家從不同角度對當?shù)豀PV16型E6、E7基因分析的過程中，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)HPV16型E6、E7基因之間存在一些細小差異。目前研究結果顯示,HPV16 型不同類型的變異株具有不同的致癌潛能和生物學活性[8]。有研究認為,病毒的致癌能力的強弱一方面與病毒的變異和類型相關,另一方面也與宿主的HLA 多態(tài)性相關。因此病毒變異株的致癌能力可能會因為地區(qū)不同而發(fā)生某些變化[9]。Yamada Matsumoto等[9]報道在日本宮頸癌患者中野生型E6 基因(德國株)分布的頻率大概為34%,然而Zehbe 等[8]報道在瑞士宮頸癌患者中該基因分布頻率僅約為6%,與印度宮頸癌患者人群中該基因的分布頻率是基本相同的[10]。參考世界各地文獻,T350G是最有特征性的E6 基因突變，但在不同的地區(qū)此變異的分布頻率不同,為3.8%-78%。在我國，高慧等[11]設計了一對跨越HPV16型 E7基因全長的引物，進行序列測定后，與網(wǎng)上公布的非洲株、東亞株、德國標準株、香港株、亞美株等HPV16型 E7基因序列予以比較，發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上揚州地方株與德國標準株99.7%是一致的，僅在E7基因的ORF199位上的T變成了C，即核苷酸三聯(lián)密碼TTG變成CTG，但其所編碼的氨基酸結構與德國標準株一致，尤其是N端蛋白活性轉化區(qū)的37個氨基酸以及C端的60個氨基酸完全相同，說明了德國標準株(野生型)與揚州地方株的HPV16型E7基因序列是大致相同的。學者們根據(jù)各地文獻所報道不同地區(qū)HPV16型 E7基因序列，制作了該基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進化圖，該圖清晰顯示東亞株、香港株、德國標準株與揚州地方株距離接近，可視為是一個系列，而非洲株和亞美株則相互接近，可視為是另一個系列，提示HR-HPV16型 E6、E7基因的突變具有明顯的地域性差異。伍欣星[12]等研究發(fā)現(xiàn)湖北地區(qū)HPV16型E7基因了出現(xiàn)新的變異株，經(jīng)序列測定顯示有兩個堿基出現(xiàn)了C→T突變，直接導致這兩個堿基所編碼的氨基酸序列的C端蛋白多肽因基因的突變提前終止，但N端則是完整的。

本組資料從深圳地區(qū)1例宮頸癌患者臨床手術標本組織中成功擴增出HPV16型 E6、E7 基因,克隆到pGEM-Teasy載體中,再經(jīng)酶切鑒定、測序后發(fā)現(xiàn)所克隆的HPV16型 E6、E7 全基因序列與Genebank 德國株序列完全一致,為日后進一步研究HPV 16 型E6、E7 基因及其蛋白表達提供了資料,為與HPV16型相關的宮頸癌治療性疫苗及診斷試劑的研發(fā)及宮頸癌防治等工作提供了信息。

作者簡介：關嵩青(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦產科臨床宮頸病變篩查及治療工作。

參考文獻：

[1]Gr Instein E,Wernet P,Sn Ijders PJF,et al.Nucleolin as Activator of Human Papillomavirus Type 18 Oncogene Transcription in Cervical Cancer[J].J Exp Med,2002,196(8):1067.

[2]Schiffman M,Herrero R,Desalle R,et al.The carcinogenicity of human papillomavirus types reflects viral evolution[J].Virology,2005,337(1):76.

[3]Khan MJ,Castle PE,Lorincz AT,Wacholder S,Sherman M,et al.The elevated 10-year risk of cervical precancer and cancer in women with human papillomavirus (HPV) type 16 or 18 and the possible utility of type-specific HPV testing in clinical practice[J].J Natl Cancer Inst,2005,97(14):1072.

[4]Jonat hor P.P21 inhibits cyclin shock[J].Nature,1994,369(16):520.

[5]Mahdav IA,Monk B J.Vaccines Against Human Papillomavirus and Cervical Cancer:Promises and Challenges[J].Oncologist,2005(10):528.

[6]Barbosa M S,Lowy D R,Schiller J T.Papillomavirus polypeptides E6 E7 are zincbinding proteins[J].J Virol,1998,63:1404.

[7]Song S Y,Pitot H C,Lambert P F.The human papillomavirus type 16 E6 gene alone is sufficient to induce carcinomas in transgenic animals[J].J Virol,1999,73(7):5887.

[8]Zehbe I,Wilander E,Delius H,Tommasino M.Human papillomavirus 16 E6 variants are more prevalent in invasivecervical carcinoma than the prototype[J].Cancer Res,1998,58(4):829.

[9] Matsumoto K,Yoshikawa H,Nakagawa S,et al.Enhanced oncogenicity of human papillomavirus type 16 (HPV16) variants in Japanese population[J].Cancer Lett,2000,156(2):159.

[10]Pande S,Jain N,Prusty BK,et al.Human papillomavirus type 16 variant analysis of E6,E7,and L1 genes and long control region in biopsy samples from cervical cancer patients in north India[J].J Clin Microbiol,2008,46(3):1060.

[11]高 慧，韓秋萍，黃正芳，等.揚州地方株HPV16E7基因的克隆及序列分析[J].中國麻風皮膚病雜志，2005，21(6)：445：

[12]伍欣星,趙文先,丁曉華,等.湖北地區(qū)宮頸癌組織中人乳頭瘤病毒16 型E7 基因的分離、克隆和序列分析[J].中國病毒學，1996,11:220.