青島地區(qū)大腸埃希菌臨床株中blaCTX-M和PMQR基因的檢測(cè)

尉鴻飛，牟曉東，朱元祺，馬金龍，趙靜宜*，劉新利

(1.齊魯工業(yè)大學(xué) 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250353;2.中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院 生物工程與技術(shù)中心，山東 青島266580;3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 青島266003)

大腸埃希菌是臨床腸桿菌科細(xì)菌中常見的機(jī)會(huì)致病菌，頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物是兩種臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素，過度使用導(dǎo)致了耐藥菌的逐漸增加。國內(nèi)傳播最廣泛的頭孢菌素耐藥基因是blaCTX-M，該基因常常位于可移動(dòng)質(zhì)粒上，造成頭孢菌素耐藥性在不同細(xì)菌間水平傳播。細(xì)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥性包括染色體編碼的垂直耐藥性和質(zhì)粒介導(dǎo)的傳播耐藥性兩種機(jī)制。由于質(zhì)粒能夠加速耐藥基因在臨床病原菌中的傳播，因而，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥性(plasmid mediated quinolone resistance，PMQR)在近十年中引起了全球關(guān)注。迄今PMQR已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了三種機(jī)制：qnr基因編碼的靶酶保護(hù)機(jī)制，aac(6’)-Ib-cr基因編碼的藥物失活機(jī)制，qepA和oqxAB基因編碼的藥物外排機(jī)制。這三種機(jī)制已經(jīng)在世界范圍30多個(gè)國家的臨床和環(huán)境分離腸桿菌中檢測(cè)到[1]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，許多臨床分離的大腸埃希菌可對(duì)頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物同時(shí)耐藥，多種PMQR基因與bla基因組合在菌株中被檢測(cè)到[2]，這將促進(jìn)臨床病原菌多重耐藥性的產(chǎn)生，進(jìn)而加劇細(xì)菌感染控制和治療的難度。本研究旨在調(diào)查青島地區(qū)大腸埃希菌臨床分離株中blaCTX-M基因和PMQR基因的流行性，為醫(yī)院感染控制和臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

107株大腸埃希菌于2012年采自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的門診和住院患者。采集樣品來自不同的臨床標(biāo)本，包括血液、膽汁、胸腹水、導(dǎo)管、咽拭子、膿瘡或傷口等。細(xì)菌鑒定采用Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，細(xì)菌耐藥性檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI 2010)進(jìn)行，以EscherichiacoliATCC25922 和KlebsiellapneumoniaeATCC700603作為質(zhì)控菌株。

1.2 主要培養(yǎng)基與生化試劑及儀器

離心柱型-基因組提取試劑盒和電泳級(jí)瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司)、PCR試劑盒和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)及限制性內(nèi)切酶FokI(大連寶生物工程有限公司)、Mueller-Hinton培養(yǎng)基(英國Oxoid公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)、Vitek-2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)(法國Biomérieux公司)。

1.3 blaCTX-M基因和PMQR基因的檢測(cè)

使用離心柱型-基因組提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，blaCTX-M基因和PMQR基因篩選引物參照文獻(xiàn)報(bào)道[3-5](見表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以細(xì)菌基因組DNA為模板，PCR檢測(cè)菌株帶有的blaCTX-M基因和各種PMQR基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA及oqxB基因)，選取代表性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定。對(duì)于aac(6’)-Ib-cr基因，PCR技術(shù)[5]檢測(cè)菌株帶有的aac(6’)-Ib基因，陽性菌株的基因擴(kuò)增產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶FokI處理并進(jìn)行DNA序列測(cè)定，鑒定cr變體。

表1 本研究使用的引物信息

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌臨床分離株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

107株大腸埃希菌均對(duì)氨芐西林耐藥，95%的菌株對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑啉和頭孢曲松耐藥，88%和82%的菌株分別對(duì)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星耐藥。89株細(xì)菌同時(shí)對(duì)頭孢菌素類及氟喹諾酮類藥物耐藥。詳見表2。

表2 大腸埃希菌對(duì)臨床常用抗生素耐藥結(jié)果(n=107)

2.2 blaCTX-M基因和PMQR基因的檢測(cè)結(jié)果

在107株臨床分離大腸埃希菌中，90株菌帶有blaCTX-M基因，64株菌帶有一種或多種PMQR基因。其中，3株帶有qnrB基因，6株帶有qnrS基因，41株帶有aac(6’)-Ib-cr基因，5株帶有qepA基因，25株帶有oqxAB基因。qnrA、qnrC、qnrD基因未檢測(cè)到。值得注意的是，60株菌同時(shí)帶有blaCTX-M和PMQR基因，其中有10株同時(shí)帶有兩種PMQR基因，包括3株帶有aac(6’)-Ib-cr和qnrS基因，3株帶有aac(6’)-Ib-cr和qepA基因，兩株帶有aac(6’)-Ib-cr和qnrB基因，兩株帶有aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因；3株同時(shí)帶有三種PMQR基因，包括1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qnrB和oqxAB基因，1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qnrS和oqxAB基因，1株帶有aac(6’)-Ib-cr、qepA和oqxAB基因。各種耐藥基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 耐藥基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

M：100 bp DNA Ladder；0：陰性對(duì)照；1：blaCTX-M基因(551 bp)；2：qnrB基因(264 bp)；3：qnrS基因(428 bp)；4：aac(6’)-Ib-cr基因(482 bp)；5：qepA基因(218 bp)；6：oqxA基因(392 bp)；7：oqxB基因(512 bp)。

3 討論

在本研究中，我們對(duì)青島地區(qū)臨床分離的107株大腸埃希菌進(jìn)行了頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物的耐藥性測(cè)定。結(jié)果表明，83%的菌株同時(shí)對(duì)頭孢菌素類和氟喹諾酮類藥物耐藥，說明分離的大腸埃希菌中存在多種耐藥基因。考慮到質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因更易引起細(xì)菌耐藥性傳播以及blaCTX-M和PMQR基因的廣泛流行，我們對(duì)細(xì)菌分離株進(jìn)行了blaCTX-M基因和四類PMQR基因的檢測(cè)。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase，ESBL)是引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)頭孢類抗生素耐藥的主要機(jī)制，而頭孢噻肟高水解酶基因blaCTX-M是我國主要流行傳播的ESBLs基因[6]。王鳳平等[7]的調(diào)查顯示，在產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌中，主要是CTX-M型。在本研究中，95%的菌株對(duì)頭孢噻肟耐藥，blaCTX-M基因在84%的菌株中被檢測(cè)到，是流行性很高的ESBL基因。

超過80%的菌株對(duì)環(huán)丙沙星或左氧氟沙星耐藥，并且60%的菌株帶有PMQR基因。其中aac(6’)-Ib-cr和oqxAB基因流行性最高。38%的菌株帶有aac(6’)-Ib-cr基因，遠(yuǎn)高于浙江溫州[8]該基因的流行率(7%)。在臨床菌株中oqxAB基因相較其他PMQR基因報(bào)道較少，本研究中23%的菌株帶有oqxAB基因，遠(yuǎn)高于上海[9]該基因的流行率(6.6%)。56%的菌株同時(shí)帶有blaCTX-M和PMQR基因，這將更有利于多重耐藥性的傳播，進(jìn)而增加細(xì)菌性感染治療的難度。

綜上，本研究得到如下結(jié)論：首次證實(shí)blaCTX-M基因和PMQR基因在青島地區(qū)臨床分離大腸埃希菌中廣泛流行，且常共存于菌株中。這將加速該地區(qū)多重耐藥菌的產(chǎn)生并增加細(xì)菌性感染治療的難度。因而，增加對(duì)臨床多重耐藥菌及耐藥基因共存的檢測(cè)，通過合理使用抗生素，防止耐藥菌株的擴(kuò)散，避免多重耐藥菌的產(chǎn)生及傳播非常緊迫。

作者簡(jiǎn)介：尉鴻飛(1986-)，男，在讀碩士研究生，主要研究方向：微生物學(xué)與分子生物學(xué)。

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