血清稀釋與否對檢測乙型肝炎核心抗體結果的影響

張碧瑩，邢延芳，王珍珠，耿 丹

(1.銅川市人民醫院 檢驗科，陜西 銅川727000；2.延安大學附屬醫院檢驗科，陜西 延安716000)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界性公共衛生關注的焦點之一，全球約有3.5億人感染，其中我國感染乙肝病毒的人口約占33%[1]。乙肝病毒血清學標志物檢測是臨床判斷患者傳染性與預后的重要指標。其中HBcAb通常在乙肝表面抗原HBsAg出現后3～5周肝炎癥狀出現前即可在血清中檢出。高濃度的HBcAb陽性常表示乙肝病毒正在復制，有傳染性。低濃度的HBcAb表示乙肝病毒既往感染，常與HBsAb陽性并存。部分接受血源性疫苗的正常人群，在乙肝表面抗體產生的同時，HBcAb也會低濃度存在。其中單項HBcAb陽性，難以確定病人是近期感染，還是既往感染，以及是否具有傳染性，需要進一步檢查HBV-DNA的病毒載量。目前我國主要采用ELISA法檢測，HBcAb檢測如做流行病學調查，可用原倍血清標本直接檢測；如作為臨床診斷依據，試劑盒使用說明書中建議將待測標本用生理鹽水1∶30稀釋后檢測。筆者探討稀釋法檢測過程中，低濃度的HBcAb血清標本呈假陰性的情況。以期對HBcAb檢測方法進行優化，提高檢測準確率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機收集無溶血、無乳糜傳染科血清標本1600例，-20℃冰箱保存。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 科美公司全自動化學發光儀，型號為CHEMCLIN600。中山大學達安基因股份有限公司實時熒光定量PCR儀，型號為DA7600。

1.2.2 試劑 北京科美生物技術有限公司HBcAb檢測試劑，批號為20130427，質控液批號為20130108。中山大學達安基因股份有限公司HBV-DNA檢測試劑，批號為2013014。HBV-DNA檢測中值和低值的質控液批號分別為2013003、2013004。選用的全部試劑均在有效使用期限之內。檢驗工作嚴格按照標準操作步驟進行，所得結果根據試劑說明書判斷。

1.3 方法

1.3.1 HBcAb的檢測 采用酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)對原倍血清和按1∶30稀釋的標本進行HBcAb檢測。

1.3.2 HBcAb的確診 采用電化學發光法(Electro Chemiluminescence Immunoassay,ECLI)對原倍血清和稀釋血清存在差異的結果進行進一步判斷。

1.3.3 HBV-DNA水平定量檢測 采用熒光定量聚合酶鏈式反應(FQ-PCR)。指定HBV-DNA定量以小于1.00×103copies/mL判定為陰性，超過該標準值者則判定為陽性。

2 結果

2.1 血清稀釋對檢測乙型肝炎核心抗體結果存在影響

ELISA法檢測原倍血清標本和稀釋血清標本，結果發現(表1)，原倍血清標本和稀釋血清標本的HBcAb均為陽性的有614例，陽性率為38.4%。原倍血清標本和稀釋血清標本的HBcAb均為陰性的有922例，陰性率為57.6%。原倍血清標本的HBcAb呈陽性，而稀釋血清標本的HBcAb呈陰性的有64例，占總標本的4.0%。

表1 ELISA法檢測原倍血清和稀釋血清的結果(n=1600)

2.2 電化學發光法檢測乙肝五項的結果

采用電化學發光法對HBcAb檢測有差異的64例原倍血清標本進行乙肝五項檢測，結果顯示(表2)，原倍血清中存在3例“大三陽”患者，6例“小三陽”患者，10例單項HBcAb陽性，45例接受疫苗注射正常標本。”電化學發光法與ELISA檢測原倍血清HBcAb陽性結果一致。

表2 電化學發光法檢測乙肝五項(n=64)

2.3 兩種方法檢測稀釋血清標本的結果

選取ELISA測定結果不一致的稀釋標本，即原倍血清標本檢測HBcAb呈陽性，而稀釋血清呈陰性的標本，共計64例。經FQ-PCR法測定發現，其中2例標本的測定值>1.00×103copies/mL，檢測結果判定為陽性，62例標本的測定值<1.00×103copies/mL，判定為陰性。這是ELISA稀釋法未檢測出的2個標本，漏檢率為3.1%。雖然按1∶30稀釋的血清標本與原倍血清標本相比，不存在統計學差異，但在一定程度上會造成漏診也是值得探討和思考的問題。

3 討論

HBV病毒屬正嗜肝病毒屬，是乙肝病毒性肝炎的病原體。抗-HBc是HBcAg的相應抗體，也是HBV感染后血清中最早出現的HBV、在人群檢出率最高的標志性抗體[2]。其持續時間長，甚至終身存在。幾乎所有個體在接觸HBV后都能產生抗-HBc，故它是HBV流行病學調查的良好指標。高濃度的抗-HBc見于急、慢性肝炎和HBsAg 攜帶者，并表明HBV復制可能仍活躍，血清具有傳染性。低濃度的抗-HBc則表示既往感染過HBV，一般無傳染性。抗-HBc不是保護性抗體，一些資料和研究表明其可調節感染肝細胞表面HBsAg 表達，從而影響殺傷性T細胞對靶細胞的影響。臨床上還常遇到單項HBcAb陽性的情況(0.9%-11.9 %) 其原因有：(1)急性感染恢復的早期，HBsAg減少或消失，而抗-HBc 尚未產生，即所謂的“窗口期”。(2)被動獲得的抗-HBc(母嬰傳播)。(3)遠期感染伴抗-HBc消失。(4)遠期感染伴低水平HBsAg。抗-HBc陽性有助于發現HBsAg陰性的HBV感染者和攜帶者，有助于獻血員的篩查，以確保臨床用血安全，有助于確診處于窗口期的急性乙型肝炎[3]。因此，正確報告HBcAb的結果顯得尤為重要[4]。

對于抗-HBc的ELISA檢測存在一個常見問題，即以ELISA為方法學原理的試劑盒說明書采用1∶30的稀釋血清標本檢測HBcAb，這是基于普遍認為檢測原倍血清標本作為流行病學調查結果，而將待測血清標本1：30稀釋后檢測作為臨床診斷依據，其理論依據是不充分的。如此造成一定程度的漏檢，可能與標本稀釋倍數偏高有關[5]。本研究結果表明，有差異的64例原倍血清樣本，經ELISA法和電化學發光法檢測，兩種方法檢測的陽性率吻合。原倍血清按1:30稀釋后，HBcAb檢測陰性的標本再用PQ-PCR檢測，檢出2例HBV-DNA陽性的標本，分別對應“大三陽”和單項HBcAb陽性的兩個標本。稀釋法檢測HBcAb假陰性的問題易造成單項HBcAb陽性的患者漏診。這對臨床確診、獻血員篩選以及院內感染的監控可能造成影響。因此，在實際工作中，結合HBV-DNA檢測十分必要。

血清HBV-DNA水平是判斷HBV復制活動最直接和最可靠的標志，其定量檢測對于了解HBV感染者的傳染性和正確判斷抗病毒治療療效具有重大意義[6]。2009年全國702家醫療機構參加衛生部質評活動的結果表明[7]，HBV-DNA準確率>99%，免疫靜默感染以及罕見的亞型與變異，是HBV-DNA低濃度感染者被漏檢的原因[8]，故檢測HBV-DNA具有實際意義，但HBV-DNA檢查作為常規項目還需要不斷探索。ELISA法和電化學發光法是目前常用的方法，但不能全面了解HBV感染及活動狀態。臨床上已普遍認可，PCR檢測HBV-DNA能真實反映HBV在體內復制與傳染性。HBsAg濃度低于檢測下限，HBsAg陰性而HBV-DNA陽性的檢測結果會對安全輸血造成嚴重威脅，目前防止輸血傳播乙肝的唯一措施是檢測HBsAg。HBcAb檢出比HBsAg更敏感，高濃度者提示有HBV活動感染；低濃度者則可能是HBV感染已恢復的標志。因此準確檢測HBcAb，結合流行病學調查，以檢查HBsAg陰性者中HBV的感染。

乙肝標志物臨床意義各異，單憑某項指標很難全面診斷病情，試劑盒的測定結果僅作為患者總體臨床評估的一部分，只有綜合多項指標及HBV-DNA的檢查結果，并結合臨床情況，才能判斷傳染性的大小和病情的輕重。通過乙肝標志物的檢測，還可考察乙肝疫苗接種后的免疫效果，也可作為治療乙型肝炎療效評價的重要指標。

參考文獻：

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[6]譚朝霞，況雪梅，丁世濤，等.慢性乙型肝炎患者5年阿德福韋酯療程中HBsAg水平變化及其與HBV-DNA水平相關性分析[J].國際檢驗醫學，2012，33(22)：2695.

[7]彭俊華，常亞麗，柴玉香，等.乙肝病毒DNA、前S1抗原及核心抗體IgM的臨床應用[J].西北國防醫學雜志，2013,34(5)：407.

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