靈芝L08對CD34+肝癌SMMC-7721細胞增殖及CD34表達的影響

周明霞，賀 靖，王潔瓊，李 浩，施佳辰，安玉會

(鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，河南 鄭州 450052)

靈芝L08對CD34+肝癌SMMC-7721細胞增殖及CD34表達的影響

周明霞，賀 靖，王潔瓊，李 浩，施佳辰，安玉會

(鄭州大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，河南 鄭州 450052)

目的探討靈芝L08對CD34+肝癌SMMC-7721細胞增殖及其CD34蛋白表達的影響。方法培養肝癌SMMC-7721細胞，并用靈芝L08處理，MTT法測定細胞增殖情況，流式細胞術測定肝癌SMMC-7721細胞中CD34+肝癌SMMC-7721細胞數量，Western blot法測定CD34蛋白的水平。結果靈芝L08處理肝癌SMMC-7721細胞后，細胞增殖率及CD34+肝癌SMMC-7721細胞數量都有所降低，CD34+肝癌SMMC-7721細胞的CD34蛋白表達水平也降低(P<0.05)。結論靈芝L08能抑制CD34+肝癌細胞的增殖及CD34蛋白的表達。

靈芝；肝癌SMMC-7721細胞；CD34；細胞增殖

目前，肝癌總體治療效果仍不理想，而導致其治療困難、病死率高的主要原因就是治療后腫瘤的復發和轉移。L08是本實驗室從靈芝中提取出的三萜類化合物，可誘導腫瘤細胞的凋亡，具有極大的抗腫瘤潛力[1]。本研究旨在觀察靈芝L08對CD34+肝癌SMMC-7721細胞增殖及其CD34蛋白表達的影響，為靈芝L08應用于肝癌臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料L08(自制)；胎牛血清、DMEM高糖細胞培養基(美國Hyclone公司)；環磷酰胺(天津金世制藥有限公司)；鏈霉素-青霉素雙抗(美國Amresco公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；DMSO、MTT試劑(美國Sigma公司)；兔抗人CD34單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2細胞培養及藥物處理肝癌SMMC-7721細胞采用體積分數10%胎牛血清及質量分數1%雙抗的DMEM高糖培養基置于37 ℃，體積分數5% CO2培養箱中培養，常規換液傳代。取對數生長期細胞進行96孔鋪板，待細胞過夜貼壁后，分別用不同濃度(100、300、500 mg·L-1)L08處理細胞24 h、48 h、72 h后MTT法測定細胞增殖情況。其中每個藥物濃度設6個復孔。對照組為未經任何處理的細胞。

1.3MTT法測定肝癌SMMC-7721細胞增殖情況加藥處理24 h、48 h、72 h的肝癌SMMC-7721細胞培養基中每孔加入 20 μL(5 mg·mL-1)MTT試劑，37 ℃培養箱孵育4 h終止培養。用移液槍吸棄上層培養液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min充分融解結晶物。選擇490 nm波長，在酶標儀上測定每個孔的光吸收度，記錄結果，實驗結果以細胞增殖抑制率表示。細胞增殖抑制率=[(1-處理組平均OD值)/對照組平均OD值]×100%。

1.4流式細胞儀測定CD34+肝癌SMMC-7721細胞數量分別收集加藥處理24 h、48 h、72 h的肝癌SMMC-7721細胞，加入PBS緩沖液及FITC標記的CD34抗體，輕輕吹打混勻，4 ℃避光孵育20 min。終止孵育后，采用PBS緩沖液洗細胞2次(2 000 r·min-1離心5 min)，加入500 μL PBS緩沖液混勻懸浮細胞后，采用流式細胞儀檢測。

1.5Westernblot法測定CD34蛋白水平參考文獻[2]中所用的本實驗室前期研究方法進行CD34+肝癌SMMC-7721細胞中CD34蛋白表達。

2 結果

2.1靈芝L08對肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制見表1。

表1 靈芝L08處理肝癌SMMC-7721細胞不同時間后的細胞增殖的抑制率 %

注：靈芝L08處理細胞后同一時間點各組抑制率兩兩比較，P<0.05

2.2靈芝L08對CD34+肝癌SMMC-7721細胞增殖的抑制見表2。

注：靈芝L08處理細胞各組抑制率兩兩比較，P<0.05

2.3靈芝L08對CD34蛋白表達的影響見圖1、表3。

圖1 靈芝L08處理肝癌SMMC7721細胞后CD34蛋白的表達

A:空白對照組；B：靈芝L08 100 mg·L-1；C：靈芝L08 300 mg·L-1；D：靈芝L08 500 mg·L-1

表3 靈芝L08處理肝癌SMMC-7721細胞后CD34蛋白表達的灰度值

注：靈芝L08處理細胞各組抑制率兩兩比較，P<0.05

3 討論

肝癌作為我國發病率及死亡率均較高的惡性腫瘤之一，其治療大都采取手術、化療、放療等方法，但總體的治療效果并不好，主要的原因就是術后腫瘤的復發和轉移[3]。肝癌組織中可能存在極少數具有干細胞特性的腫瘤細胞，這是腫瘤復發和轉移的根源[4]。因此對肝癌干細胞的研究被認為是了解肝癌復發和轉移的新途徑之一。

目前，國內外對肝癌干細胞表面標志物的研究尚無明確定論。本實驗室前期研究[5]發現，靈芝L08可抑制CD133+肝癌SMMC-7721細胞的增殖和CD133蛋白的表達，由于尚未發現肝癌干細胞特異的表面標志物，僅選擇CD133作為生物標志物，尚不能說明靈芝L08可抑制肝癌干細胞的增殖。因此，本實驗選擇了以CD34作為另外一種標志物，進一步驗證靈芝L08是否對肝癌干細胞產生了作用。CD34作為一種跨膜的表面糖蛋白，在肝癌組織中的表達主要與腫瘤新生血管有關，可以作為觀察肝癌血管形成的一個標志物[6]。CD34在正常的肝竇內皮細胞中不表達，但可作為反映肝竇毛細血管化的有效指標[7]。

研究[8-9]表明，包括L08在內的靈芝中的三萜類成分可通過抑制蛋白激酶C活性同時激活有絲分裂活性蛋白激酶，使腫瘤細胞G2期延長，從而抑制腫瘤細胞的生長，最終起到抗腫瘤作用。本研究選擇CD34+肝癌SMMC-7721細胞作為研究對象，探討天然藥物對其增殖的抑制作用。結果顯示，靈芝L08可顯著抑制CD34+肝癌SMMC-7721細胞的增殖及CD34蛋白的表達，且抑制率具有時間和濃度依從性。說明靈芝L08可有效抑制肝癌干細胞的增殖，這為天然藥物應用于臨床肝癌的治療提供了理論依據。但本實驗尚存在許多不足之處，首先，目前對三萜類化合物的分離純化存在一定的困難，這就限制了對這些化合物的進一步研究和開發。其次，目前尚未明確肝癌干細胞的特異性表面標志物，所以僅用CD34作為標志物說服力較弱，尚需進一步完善實驗從而得到更準確的結論。

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EffectofGanodermaL08ontheProliferationandCD34ExpressionofCD34+LiverCancerSMMC-7721Cells

Zhou Mingxia,He Jing,Wang Jieqiong,Li Hao,Shi Jiachen,An Yuhui

(DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BasicMedicalCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo explore the effect of ganoderma L08 on the proliferation and CD34 expression of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells.MethodsLiver cancer SMMC-7721 cells were cultured and treated with ganoderma L08.Cell proliferation was detected by MTT method.The numbers of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells were measured by flow cytometry.The level of CD34 protein was measured by western blot method.ResultsAfter the treatment of ganoderma L08,the proliferation rate of liver cancer SMMC-7721 cells and numbers of CD34+liver cancer SMMC-7721 cells were both decreased,and the level of CD34 protein in CD34+SMMC-7721 cells was decreased (P<0.05).ConclusionGanoderma L08 could inhibit the proliferation and CD34 expression in CD34+liver cancer SMMC-7721 cells.

ganoderma; liver cancer SMMC-7721 cells; CD34; cell proliferation

安玉會(1952-)，男，教授，主要從事老年癡呆發生的分子機制及腫瘤干細胞方面的研究。E-mail：yuhuian@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.04.001

R735.7；R273

A

1673-5412(2014)04-0277-03

2014-01-07)