納米雄黃對皮膚鱗癌A431細胞p53、Bcl-2表達的影響及相關機制探討※

齊元富 李慧杰 顏 芹

(山東中醫藥大學附屬醫院腫瘤科，山東 濟南 250011)

納米雄黃對皮膚鱗癌A431細胞p53、Bcl-2表達的影響及相關機制探討※

齊元富 李慧杰 顏 芹

(山東中醫藥大學附屬醫院腫瘤科，山東 濟南 250011)

目的探討納米雄黃對皮膚鱗癌A431細胞p53、Bcl-2表達的影響及相關機制。方法通過細胞培養，應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術、免疫組化法觀察納米雄黃干預p53、Bcl-2在人皮膚鱗癌A431細胞中的表達情況。結果各濃度納米雄黃干預組、注射用順鉑(DDP)干預組及聯合用藥組的Bcl-2陽性率均明顯低于對照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，Bcl-2陽性率也明顯降低(P<0.05)；聯合用藥組的Bcl-2陽性率明顯低于各濃度納米雄黃干預組和DDP干預組(P<0.05)。各濃度納米雄黃干預組、DDP干預組及聯合用藥組的p53的相對灰度值(RATIO)均明顯高于對照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，p53的RATIO明顯升高(P<0.05)；聯合用藥組的p53的RATIO明顯高于各濃度納米雄黃干預組和DDP干預組(P<0.05)。各濃度納米雄黃干預組條帶灰度高于對照組；5%、10%、20%納米雄黃干預組條帶亮度依次變大；聯合用藥組條帶亮度較DDP干預組、各濃度納米雄黃干預組大，內參β-actin見不到肉眼可見的濃度變化。結論納米雄黃可上調p53表達和下調Bcl-2表達，與DDP聯合應用有協同作用，可能是納米雄黃誘導人皮膚鱗癌A431細胞凋亡的機制之一。

癌，鱗狀細胞；皮膚腫瘤；雄黃；藥理學；細胞凋亡

近年來，皮膚癌發病率逐年上升，由于其侵襲性和轉移能力強，越來越受到人們的重視。中醫學認為，皮膚為人之藩籬，容易受到外邪侵襲，外感六淫，風毒燥熱之邪久羈留戀，內耗陰血，奪精灼液，或濕毒久留，皆可變生惡瘡，發為本病。而現代醫學對皮膚癌的病因尚未完全明了，認為其發生可能與過度的日光曝曬、放射線、砷劑、焦油衍化物等長期刺激有關，具體機制則有待進一步探討[1]。雄黃始載于《神農本草經》，是外用治療疥瘡的要藥，而現代醫學研究認為雄黃具有抗腫瘤效應，多用于皮膚癌、子宮頸癌等多種癌癥的治療[2]。而雄黃納米化后作用更顯著，本研究旨在觀察納米雄黃對皮膚鱗癌A431細胞p53、Bcl-2表達的影響，并探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株，購自中國協和醫科大學。

1.2 主要試劑藥品 DMEM高糖培養基[賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司]；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；兔抗人Bcl-2單克隆抗體、濃縮型鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(博士德生物工程有限公司)；總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；p53介導Wip1上下游引物及內參基因β-actin由中山大學達安基因股份有限公司(廣州)合成(Wip1上游引物：5'-AAGAAACTGGCGGAATGGC-3'，下游引物：5'-CCAA GAACCA CCCCTGAGTC-3'，分子量：131 bp；內參基因β-action上游引物序列為5'-GCATGGG TCAGAAGGATTCCT-3'，下游引物序列為5'-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3'，片斷長度為106 bp)；注射用順鉑(DDP，齊魯制藥有限公司)。

1.3 主要儀器 二氧化碳(CO2)培養箱BB5060UV型(德國Heraeus公司)；超凈工作臺ClassⅡ2085型[美國(熱電)Thermo Forma公司]；倒置相差顯微鏡1X50S8F型(日本Olympus公司)；凝膠成像分析系統2200型(美國阿爾法科技公司)；T-Gradient梯度PCR儀(德國BIOMETRA公司)；PCR儀Sprint型(美國Thermo Hybaid公司)。

1.4 納米雄黃制備 雄黃原藥購自陜西康惠制藥股份有限公司(批號：091201)，后由山東龍脈科技發展有限公司龍脈精研機(LVM-80WE型)研磨納米化，再于濟南微納顆粒技術有限公司Winner801光子相關納米激光粒度分析儀測定納米雄黃顆粒尺寸大小和粒徑分布，平均粒徑約72.79 nm，符合納米藥物制劑要求。納米雄黃用氯化鉀(KCl)飽和硝酸溶液溶解，氫氧化鈉(NaOH)調pH至7.0，磷酸鹽緩沖液(PBS)定容，配成 2 mg/mL的混懸液，過濾除菌，4 ℃保存備用。

1.5 實驗分組 ①對照組：含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基；②納米雄黃干預組：設置5%、10%、20%納米雄黃3個濃度水平；③DDP干預組：DDP終濃度為2 g/mL；④聯合用藥組：10%納米雄黃+DDP。

1.6 細胞培養及其懸液制備 將人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中、37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養，細胞貼壁生長待細胞長滿貼壁，即可傳代，一般3 d傳代1次，實驗時取對數生長期細胞。制備細胞懸液時取對數期生長的人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株，經0.25%胰酶消化，計數后細胞加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中培養制備待用。

1.7 免疫組化法測定 將經過高溫消毒的蓋玻片放入六孔板中，取A431細胞懸液接種于內繼續培養，待細胞爬滿玻片后棄液，按實驗分組加藥，再繼續培養24 h，棄液PBS清洗，95%乙醇固定30 min，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚室溫孵育15 min，3%雙氧水室溫孵育，封閉血清室溫孵育，一抗工作液濕盒37 ℃孵育60 min，PBS清洗，二抗工作液濕盒37 ℃孵育30 min，PBS清洗，SABC濕盒37 ℃孵育30 min，DAB染色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復染，自來水洗滌泛藍，梯度酒精脫水，加二甲苯，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析。光學顯微鏡下，選擇免疫組化玻片陽性細胞(陽性細胞為胞漿、胞核、胞膜，為棕黃色顆粒)較集中的區域采集3～5個光鏡視野輸入到HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統內，在相同的背底倍體條件下選擇相應的參數進行計算機完全定量分析。

1.8 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測 提取總RNA：將A431細胞懸液接種于六孔板，繼續培養待細胞生長旺盛貼壁后棄液，按實驗分組加藥，繼續培養24 h，經0.25%胰蛋白酶液制成細胞懸液，分別裝入離心管，400 r/min離心10 min，收集細胞，按總RNA提取試劑盒操作步驟提取各組細胞總RNA，經ND-1000檢測RNA的純度與含量用于RT-PCR檢測，具體參照試劑盒說明書。用凝膠成像系統自帶的分析軟件分析各目的條帶和內參的平均密度值，即灰度值(IDV)。相對灰度值(RATIO)(%)=目的條帶的IDV/內參的IDV×100%。

3)通過在軟件系統平臺和技術架構中融入GIS，可保證大數據分析過程的可視化和分析結果時空位置動態展示的可操作性和實用性。

1.9 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件包進行統計學分析，數據采用單因素方差分析，檢驗標準以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化法檢測納米雄黃對A431細胞Bcl-2表達的影響 見表1。

組 別陽性率(%)對照組76．80±1．045%納米雄黃干預組66．98±1．95?○10%納米雄黃干預組60．22±0．85?△○20%納米雄黃干預組55．24±1．16?△#○DDP干預組44．28±0．77?○聯合用藥組27．47±0．62?

與對照組比較，*P<0.05；與5%納米雄黃干預組比較，△P<0.05；與10%納米雄黃干預組比較，#P<0.05；與聯合用藥組比較，○P<0.05

由表1可見，各濃度納米雄黃干預組、DDP干預組及聯合用藥組的Bcl-2陽性率均明顯低于對照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，Bcl-2陽性率也明顯降低(P<0.05)；聯合用藥組的Bcl-2陽性率明顯低于各濃度納米雄黃干預組和DDP干預組(P<0.05)。

2.2 RT-PCR法檢測納米雄黃對A431細胞p53介導Wip1mRNA表達的影響 見表2。

組 別RATIO(%)對照組16．25±2．315%納米雄黃干預組22．78±4．21?○10%納米雄黃干預組29．60±2．85?△○20%納米雄黃干預組38．61±2．44?△#○DDP干預組56．81±5．54?○聯合用藥組69．25±2．83?

與對照組比較，*P<0.05；與5%納米雄黃干預組比較，△P<0.05；與10%納米雄黃干預組比較，#P<0.05；與聯合用藥組比較，○P<0.05

由表2可見，各濃度納米雄黃干預組、DDP干預組及聯合用藥組的p53的RATIO均明顯高于對照組(P<0.05)；隨著納米雄黃濃度的升高，p53的RATIO明顯升高(P<0.05)；聯合用藥組的p53的RATIO明顯高于各濃度納米雄黃干預組和DDP干預組(P<0.05)。

2.3 p53介導Wip1mRNA的RT-PCR圖 各濃度納米雄黃干預組條帶灰度高于對照組；5%、10%、20%納米雄黃干預組條帶亮度依次變大；聯合用藥組條帶亮度較DDP干預組、各濃度納米雄黃干預組大，內參β-actin見不到肉眼可見的濃度變化。見封3，圖1。

3 討 論

皮膚癌的發生是一個長時間、多因素、多階段的復雜過程。皮膚鱗癌位置淺表，易于操作，臨床治療方法較多，主要有手術治療、放射治療、激光和冷凍治療、藥物治療等，由于各種方法的適應證各不相同，因此其治愈率和復發率也不盡相同[3]。對于某些不適于接受外科手術治療或術后需預防復發的病例，研究有效的抗腫瘤藥物意義重大。雄黃的應用歷史悠久，主要活性化學成分為四硫化四砷(As4S4)，其可通過誘導腫瘤細胞凋亡，抑制細胞DNA合成，增強機體的細胞免疫功能等多種因素發揮抗腫瘤作用，而納米雄黃相對普通雄黃有明顯的增效作用，且在抑制細胞增殖及誘導凋亡方面彰顯優勢[4]。Bcl-2是凋亡分子機制研究的主要靶分子，是一種抑制細胞凋亡的基因，已有研究表明Bcl-2在皮膚鱗癌中廣泛表達，而p53蛋白的抗腫瘤作用主要是通過調控下游基因如p21Waf 1/cip l促使細胞停止在G1期，讓受損的細胞有足夠的時間修復或發生凋亡，而無法進入S期，從而抑制細胞的增殖[5-6]。目前，關于雄黃抗腫瘤作用的文獻研究很多，但是有關納米雄黃對人皮膚鱗癌A431細胞作用的研究卻較少。

本研究旨在從納米雄黃干預p53、Bcl-2在人皮膚鱗癌A431細胞中的表達切入，進一步探討其可能的分子生物學機制。研究結果顯示，納米雄黃、DDP及DDP+納米雄黃均能明顯抑制Bcl-2的活性；隨著納米雄黃藥物濃度的升高，Bcl-2陽性率也明顯降低，Bcl-2的活性與納米雄黃的濃度成負性相關；DDP+納米雄黃對Bcl-2的抑制作用明顯高于單用納米雄黃或單用DDP，二者聯合用藥有協同作用。納米雄黃、DDP及DDP+納米雄黃均能明顯增加p53的表達，隨著納米雄黃藥物濃度的升高，p53的RATIO明顯升高，p53的表達與納米雄黃的給藥濃度成正性相關；DDP+納米雄黃對p53表達的促進作用明顯優于單用納米雄黃或單用DDP，可以推斷二者聯合用藥有協同作用。本研究初步揭示納米雄黃可上調p53表達和下調Bcl-2表達，其可能是納米雄黃誘導人皮膚鱗癌A431細胞凋亡的機制之一。

[1] 孫玉紅.皮膚癌的發病因素調查分析[J].皮膚病與性病，1990，12(1)：31-34.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：610.

[3] 王文鑫，王曉彥.皮膚鱗狀細胞癌及基底細胞癌的治療進展[J].內蒙古醫學雜志，2008，40(11)：1346-1349，1338.

[4] 葉曉川，楊祥良，徐輝碧.納米雄黃研究進展[J].化學進展，2009，21(5)：934-939.

[5] 王成海.細胞凋亡與Bcl-2在皮膚鱗形細胞癌中的表達及意義[J].江蘇臨床醫學雜志，2001，5(3)：199-201.

[6] 袁璧釵，林東.腫瘤抑制基因p53與人類腫瘤研究進展[J].基層醫學論壇，2005，9(10)：929-930.

(本文編輯：習 沙)

·信息·

南方四省發布H7N9疫情

1月10日～12日，廣東省衛生計生委、浙江省衛生計生委、江蘇省衛生廳、福建省衛生計生委分別發布人感染H7N9禽流感疫情。 廣東省新增4例人感染H7N9禽流感病例，1例病情危重，3例病情穩定或較輕；浙江省新確診5例人感染H7N9禽流感病例，1例死亡，3例病情危重，1例為重癥；江蘇省新增1例人感染H7N9禽流感確診病例，病情穩定；福建省確診1例人感染H7N9禽流感病例，患者經搶救無效死亡。

InvestigationoftheeffectandmechanismofrealgarnanoontheexpressionofP53andBcl-2inskinsquamouscellcarcinomaA431cells

QIYuanfu，LIHuijie，YANQin.

DepartmentofOncology，AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shandong，Jinan250011

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of realgar nano on the expression of P53 and Bcl-2 in skin squamous cell carcinoma A431 cells.MethodsThe effect of realgar nano on the expression of P53 and Bcl-2 in skin squamous cell carcinoma A431 cells were observed by cell culture，RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsPositive rate of Bcl-2 in different concentration groups of realgar nano，DDP group and combination drug therapy group was higher than that in control group(P<0.05).Positive rate of Bcl-2 was decreased with the increase of realgar nano concentration(P<0.05).Positive rate of Bcl-2 in combination drug therapy group was lower than that in different concentration groups of realgar nano and DDP group(P<0.05).The mean gray value of p53 in different concentration groups of realgar nano，DDP group and combination drug therapy group was higher than that in control group(P<0.05).The mean gray value of p53 was increased with the increase of realgar nano concentration(P<0.05).The mean gray value of p53 in combination drug therapy group was higher than that in different concentration groups of realgar nano and DDP group(P<0.05).Striped gray in different concentration groups of realgar nano was higher than that in control group(P<0.05).Striped gray in 5%，10% and 20% realgar nano group was increased.Striped gray in combination drug therapy group was higher than that in different concentration groups of realgar nano and DDP group(P<0.05).ConclusionRealgar nano may down regulate the expression of Bcl-2 and has synergistic effect by combination of DDP，one of the mechanisms may be nano realgar-induced human skin squamous cell apoptosis of A431 cells.

Carcinoma；Squamous cell；Skin cancer；Realgar；Pharmacology；Apoptosis

※ 項目來源：山東省自然科學基金資助項目(編號：ZR2010HL050)作者簡介：齊元富(1963—)，男，主任醫師，教授，博士。從事中西醫結合腫瘤防治研究工作。

R392.11；R730.261；R739.5；R739.502.2；R730.261

A

1002-2619(2014)01-0109-03

2013-01-18)