吳茱萸堿抑制涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞侵襲的實驗研究

陳彪 屈鵬飛 賈志宇 李曉玲 楊威 張英懷

·論著·

吳茱萸堿抑制涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞侵襲的實驗研究

陳彪 屈鵬飛 賈志宇 李曉玲 楊威 張英懷

目的研究吳茱萸堿對涎腺腺樣囊性癌 ACC-M 細胞侵襲的影響。方法用終濃度為0、 0.01、 0.1、 1、 10、 100 μg/ml的吳茱萸堿處理 ACC-M細胞2、4、6、8、10 h后，應用transwell小室侵襲實驗檢測和觀察ACC-M細胞的侵襲抑制情況。結果吳茱萸堿處理組較對照組穿過上室底面膜的細胞數少，細胞數隨濃度增大，時間增長基本呈遞減趨勢，侵襲抑制率隨濃度的增大而增大，隨時間的增長而增大，侵襲抑制率最高可達59.99%。結論吳茱萸堿可以抑制涎腺腺樣囊性癌 ACC-M細胞侵襲。

吳茱萸堿；涎腺腺樣囊性癌；侵襲

涎腺腺樣囊性癌是最常見的惡性腫瘤之一，浸潤性極強和易發生遠處轉移是腺樣囊性癌的重要特征，因此術后復發率高，生存率也比較低[1]。目前具有抗腫瘤活性的植物有效成分受到了極大關注[2]，吳茱萸堿(evodiamine)就是其中之一,研究表明，吳茱萸堿可以誘導涎腺腺樣囊性癌細胞凋亡并抑制細胞增殖[3]。但是，吳茱萸堿是否能抑制涎腺腺樣囊性癌細胞的侵襲，國內外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 人涎腺腺樣囊性癌細胞系 ACC-M 由上海交通大學口腔頜面外科實驗室提供。采用 RPMI 1640 培養基加入10% 胎牛血清和抗生素，于37℃、5% CO2恒溫箱內飽和濕度培養，24～48 h傳1 代，以0．04%二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)和0.25%胰蛋白酶混合液消化傳代。吳茱萸堿購自中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%。用二甲基亞砜配制成100 mg/ml的儲存液，儲存于-20℃冰箱中。使用前用培養液稀釋，培養液中加入等量二甲基亞砜作為對照組。Matrigel基質膠，購自美國BD公司(貨號356234)。Transwell小室，購自美國康寧公司(貨號3422)。肝細胞生長因子(HGF)，PROSPEC產品(貨號CYT-244)。

1.2 方法

1.2.1 transwell小室侵襲實驗：每一個transwell小室上室膜的底面預先鋪好Matrigel基質膠 50 μl(將50 μl的微量加樣器末端剪去后逐個加入)；下室內加入含有肝細胞生長因子(HGF)(化學趨化物)的細胞培養液200 μl(30 μg/200 ml)；取對數生長期(即是細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究的時期)的細胞，用10%的細胞培養液制成單細胞懸液20 ml，其內共有細胞數為1.8×107個。在每個transwell小室的上室分別加入含有 2×105個分別用0 μg/ml(空白對照)，0.01 μg/ml，0.1 μg/ml，1 μg/ml，10 μg/ml，100 μg/ml的吳茱萸堿處理(37℃，20 min)的ACC-M細胞混勻液200 μl，37℃，5%CO2的條件下孵育；共5組，每組3個副孔；反應2、4、6、8、10 h后，在相應的時間，將相應的實驗組小室上室面微孔膜上的細胞用棉簽擦去(注意保護下室面膜上細胞不受影響)，10%甲醛溶液固定30 min后行Wright-Giemsa染色。

1.2.2 細胞計數：將小室由培養板中取出，將上室底部的整個膜以“井”字劃分為9格，在400×鏡下觀察，在中心格隨機選一個視野，膜周邊格隨機選四個格，各選一個視野，計數5個視野穿過微孔膜的細胞總數。每組4個樣本。侵襲抑制率公式如下：(對照小室穿膜細胞數均值-處理小室穿膜細胞數均值)/對照小室穿膜細胞數均值×100%。

1.3 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，使用Mauchly的球形度檢驗(P=0.141>0.01)，得出數據滿足協方差矩陣球對稱的條件，不需對結果進行校正。而后進行主體內效應檢驗，檢驗時間組合濃度組之間是否存在交互作用；使用Kruskal-Wallis 檢驗分別檢驗5個時間組間和5個濃度組間以及時間組和濃度組之間是否存在差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

本實驗應用Matrigel基質膠，模擬體外侵襲模型中的細胞外基質(ECM)的作用，觀察吳茱萸堿對人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞系侵襲能力的影響。與對照組比較，各處理組的穿膜細胞數隨著藥物濃度的增加而減少，隨著時間的增長而減少；根據穿膜細胞數計算出侵襲抑制率，侵襲抑制率呈現隨著藥物濃度的增高，時間的增長而增大的趨勢；在10 h，100 μg/ml時侵襲抑制率可達59.99%。經統計學分析，不同藥物濃度組之間差異有統計學意義(F=7.245，P<0.05)，即穿膜數細胞和藥物濃度之間為依賴關系，隨著藥物濃度的增加，穿膜細胞數減少，侵襲抑制率增大；但不同時間組之間差異無統計學意義(F=7.050，P>0.05),即時間組和侵襲抑制率之間無依賴關系可循；時間組與濃度組之間不存在交互作用(F=1.426，P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各吳茱萸堿處理組穿膜細胞數

表1 各吳茱萸堿處理組穿膜細胞數

組別2h4h6h8h10h0μg/ml組217.7±8.0224.3±6.1225.3±9.4226.7±10.0231.7±15.60.01μg/ml組171.7±4.5162.3±6.5159.0±4.0153.7±3.1148.3±4.50.1μg/ml組160.3±3.1158.0±6.6153.3±3.5150.0±6.0140.0±13.01μg/ml組155.3±11.9147.0±5.3144.0±5.0140.7±9.1134.0±11.510μg/ml組139.3±1.5134.7±5.8130.3±9.0129.7±9.4114.7±3.2100μg/ml組126.7±7.0123.7±6.1115.3±6.0106.3±17.692.7±5.7

圖1 不同時間組和濃度組的侵襲抑制率

3 討論

傳統醫學認為吳茱萸有溫中散寒，疏肝止痛之功效，常用于脘腹冷痛，嘔吐腹瀉，頭痛胃痛和痛經等。近代醫學證明吳茱萸有鎮痛，安神，抗菌，降壓等藥理作用[4]。目前，國內外對于吳茱萸堿抗腫瘤作用的研究較少。Ogasawara等[5-7]研究了吳茱萸堿對結腸癌細胞26-L5，Lewis肺癌細胞LLC和惡性黑色素瘤細胞 B16-F10的作用，發現吳茱萸堿可通過濃度依賴方式抑制結腸癌細胞26-L5的侵襲，在10 mg/ml濃度時可達到70%的抑制。用10 mg/ml濃度吳茱萸堿處理過的LLC 和26-L5腫瘤細胞接種于裸鼠體內后，可顯著降低肺轉移和肝轉移。其中吳茱萸堿處理過的26-L5細胞肺轉移減少了70%。接種26-L5細胞后第6天開始應用吳茱萸堿的裸鼠，與對照組相比，肺內腫瘤結節的數目減少48%。吳茱萸堿以濃度依賴方式抑制腫瘤細胞的侵襲與轉移，在30 mmol/L濃度時對3種細胞系均達到完全抑制[5-7]。近來研究表明吳茱萸堿對舌鱗狀細胞癌Tca-8113 細胞有明顯的放射增敏作用，并能改變 Tca-8113 細胞的黏附和遷移能力[8]。這些結果表明，吳茱萸堿可用于抗腫瘤侵襲和轉移的治療。

本研究用 Matrigel基質膠觀察細胞侵襲力，在體外模擬腫瘤細胞侵襲的過程。結果顯示經過不同濃度的吳茱萸堿處理過的 ACC-M 細胞與對照組相比，其細胞的侵襲穿膜率受到抑制，侵襲抑制率隨著藥物濃度的增加和時間的增長而增大；在10 h，100 μg/ml時侵襲抑制率可達59.99%；經統計學分析，不同的濃度組之間存在差別(P<0.01)，吳茱萸堿對人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞系侵襲力的影響和其本身的藥物濃度呈依賴關系，在一定的藥物濃度范圍內，濃度越高抑制作用越明顯；而時間對于細胞抑制率的影響經統計學分析不存在差別(P>0.01)，也就是說本實驗設定的時間組得到的實驗結果并不能說明吳茱萸堿對與人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞系侵襲的抑制作用呈時間依賴性；這可能一方面與本實驗設定的時間組之間間隔短有關系，另一方面與實驗體系及不同腫瘤細胞系本身的特異性有關系。另外時間組和濃度組對于人涎腺腺樣囊性癌ACC-M細胞系侵襲的抑制作用不存在交互性(P<0.01)。

目前，關于吳茱萸堿抗腫瘤的機制尚不確切，有文獻報道，吳茱萸堿通過抑制NF-kB[9]的活性來抑制NF-kB激活通路上的關鍵環節阻斷其激活過程，以達到阻斷 NF-kB調控的抗凋亡基因及促進腫瘤細胞生長、浸潤、轉移的基因轉錄。另外通過原位分析技術，人們發現吳茱萸堿可抑制微管蛋白的多聚化和紡錘體的形成，并且進一步的研究中發現，吳茱萸堿 N-14位上的甲基和 C-13位上的氫與吳茱萸堿的抗腫瘤活性有很大的相關性[10]。亦可能與下調PLK1基因表達有關[11]。但具體機制還需進一步研究。

1 楊威，陳彪，張英懷，等．姜黃素對涎腺腺樣囊性癌細胞系SACC-83增殖和凋亡的影響.現代口腔醫學雜志，2009，23:142-144．

2 賈志宇，陳彪，郭立華，等．丹參酮ⅡA 對舌鱗狀細胞癌細胞系 TCA-83 增殖和凋亡的影響．實用口腔醫學雜志，2012，28: 59-63．

3 賈志宇,邸永賓,李曉玲,等.吳茱萸堿抑制涎腺腺樣囊性癌細胞系 ACC-M 增殖的實驗研究．實用口腔醫學雜志,2012，28:592-596.

4 劉蘊秀,羅淑榮.吳茱萸中生物堿成分的研究新進展．天然產物研究與開發,2000,12:87-94.

5 Ogasawara M,Matsubara T,Suzuki H,et al.Inhibitory effects of evodiamine on in vitro invasion and experimental lung metastasis of murine colon cancer cells.Biol Pharm Bull,2001,24:917-920.

6 Ogasawara M,Matsubara T,Suzuki H.Screening of natural compounds for inhibitory activity on colon cancer cell migration.Biol Pharm Bull,2001,24：720-723.

7 Ogasawara M,Suzuki H.Inhibition by evodiamine of hepatocyte growth factor-induced invasion and migration of tumor cells.Biol Pharm Bull,2004,27：578-582.

8 馮蕊，何津祥，國晉菘，等.吳茱萸堿聯合射線對舌鱗狀細胞癌Tca-8113細胞增殖、黏附和遷移的影響.腫瘤,2011,31:417-423.

9 Takada Y,Kobayashi Y,Aggarwal BB.Evodiamine Abolishes Constitutive and Inducible NF-B Activation by Inhibiting IB Kinase Activation,Thereby Suppressing NF-B- regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression Up-regulatingApoptosis and In-hibiting Invasion.J Biol Chem,2005,280:203-212.

10 Huang DM,Guh JH,Huang YT,et al.Induction of mitotic arrest and apoptosis in human prostate cancer pc-3 cells by evod iamine.J Urol,2005,173:256-261.

11 程兆明,周永靜,張尤歷，等.吳茱萸堿對人胃癌SGC7901細胞增殖、侵襲和保羅樣激酶-1基因表達的影響．江蘇大學學報(醫學版)，2011，21:69-72．

ExperimentalstudyoftheeffectofevodiamineontheinvasionofsalivaryadenoidcysticcarcinomaACC-Mcells

CHENBiao,QUPengfei,JIAZhiyu,etal.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China.

ObjectiveTo investigate the effects of evodiamine on the invasive behaviors of salivary adenoid cystic carcinoma ACC-M cells.MethodsACC-M cells were treated with evodiamine at 0,0.01,0.1,1,10,100μg/ml for 2h,4h,6h,8h,10h,respectively,then transwell invasion assay was used to examine the inhibition invasion condition of ACC-M cells.ResultsAs compared with that in control group,the number of the cell though the upper chamber in the evodiamine-treatment group was decreased.The cells' number showed a gradual decreasing trend with concentration increasing and time prolonging.The invasion inhibition rate was increased with the increasing of drug concentration and action time.The highest invasion inhibition rate was 59.99%.There was a significant difference in number of the cell though the upper chamber among different concentration groups (P<0.05).ConclusionEvodiamine is able to inhibit the invasion of ACC-M cells.

evodiamine;salivary adenoid cystic carcinoma;invasion

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.09.003

項目來源:河北省醫學科學研究重點課題(編號:2005007)；河北省中醫藥管理局項目(編號:2006093)

050000 石家莊市，河北醫科大學第二醫院口腔頜面外科[陳彪、屈鵬飛、賈志宇、李曉玲(現工作單位為解放軍306醫院口腔科)、楊威、張英懷]

R 871.7

A

1002-7386(2014)09-1290-03

2013-11-05)