一種快速、簡(jiǎn)便的模板提取方法用于PCR檢測(cè)糞便中的金黃色葡萄球菌的研究

付素蘭 劉景武 孫文澤

·論著·

一種快速、簡(jiǎn)便的模板提取方法用于PCR檢測(cè)糞便中的金黃色葡萄球菌的研究

付素蘭 劉景武 孫文澤

目的建立一種快速、簡(jiǎn)便的模板提取方法用于PCR檢測(cè)糞便中的金黃色葡萄球菌。方法利用FTA濾膜,無需增菌，直接從人工污染金黃色葡萄球菌的糞便中提取DNA模板，以金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc)為靶基因，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到279 bp的產(chǎn)物。通過凝膠電泳，和凝膠成像技術(shù)觀察結(jié)果。結(jié)果使用FTA濾膜可有效的提取DNA模板，消除了樣本中的PCR抑制因子，通過PCR方法檢測(cè)人工污染的糞便中的金黃色葡萄球菌，檢出限為102 cfu/ml，可在6 h內(nèi)完成檢測(cè)。結(jié)論FTA濾膜用于PCR檢測(cè)糞便中的金黃色葡萄球菌操作簡(jiǎn)便、快速。使用FTA濾膜法制備模板DNA,為食源性致病菌快速檢測(cè)構(gòu)建了一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。

PCR；糞便；金黃色葡萄球菌；FTA 濾膜

目前，對(duì)于金黃色葡萄球菌有很多檢測(cè)方法，在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。傳統(tǒng)檢測(cè)方法是可靠，但費(fèi)力、耗時(shí)，不能滿足臨床診斷的需要。分子生物學(xué)方法具有靈敏度高，快速的特點(diǎn)，但必須制備高純度的模板，而糞便中主要是一些食物殘?jiān)缰尽⒅参锢w維、蛋白質(zhì)等，這些抑制因子的存在大大降低了PCR檢測(cè)的靈敏度，因而，限制了PCR方法在臨床檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。所以，如何制備高純度的模板成為關(guān)鍵。FTA濾膜能在室溫下對(duì)各種生物樣品進(jìn)行收集、運(yùn)輸、存檔,還可以用于核酸純化，進(jìn)行PCR、 SNP、RT-PCR、 RFLP 分析，其最早是用于儲(chǔ)存血液樣品，F(xiàn)TA 卡是將變性劑和螯合劑滲透在纖維基質(zhì)上，當(dāng)捕捉到細(xì)胞后能自動(dòng)將其裂解，DNA吸附在FTA 卡上經(jīng)干燥后既可長期保存，也可以用專用緩沖液洗滌，去除樣品中的雜質(zhì)、細(xì)胞殘片，以及其他PCR抑制因子的干擾，可直接作為模板用于PCR反應(yīng)[1-6]。鑒于FTA 濾膜具有以上優(yōu)點(diǎn)，本研究以金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc為靶序列，使用FTA濾膜直接制備DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增來直接檢測(cè)糞便中的金黃色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種：Staphylococcus aureus(金黃色葡萄球菌)-ATCC6538、ATCC25923、ATCC13565、ATCC14458、ATCC8095。以上菌種分別購自中國普通微生物菌種保藏管理中心和中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。菌種接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃，搖瓶過夜培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，購自北京市陸橋技術(shù)有限公司。

1.1.3 糞便標(biāo)本為我院臨床病人標(biāo)本，經(jīng)培養(yǎng)證明無金黃色葡萄球菌生長。

1.1.4 化學(xué)試劑：Premix Taq DR004A、DNA Marker DL2000，購自大連寶生物工程公司引物(正向引物,反向引物)由大連寶生物工程公司合成。FTA Filter: 購自 Whatman公司 FTA緩沖液: 購自Whatman公司

1.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀為Whatman T Gradient基因擴(kuò)增儀，電泳儀為北京市六一廠生產(chǎn)DXY-33A型電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)為華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司UVIpro凝膠成像系統(tǒng)，2.00 mm Harris Micro Punch and Mat 購自Whatman公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品人工污染：便標(biāo)本為我院臨床患者標(biāo)本，在人工污染金黃色葡萄球菌前，經(jīng)培養(yǎng)證明無金黃色葡萄球菌生長。取過夜培養(yǎng)的沙門氏菌肉湯培養(yǎng)液，調(diào)整菌液濃度為2×101～2×1010cfu/ml，取1 ml加入1 g(1 ml)糞便標(biāo)本中混勻。

1.2.2 DNA提取：取20 μl人工污染樣本滴入加有直徑2.00 mm FTA濾膜片的離心管中，然后56℃干燥，干燥后的FTA 濾膜片，加入10% SDS溶液200 μl煮沸10 min，用FTA專用緩沖液洗滌2次，然后再用TE緩沖液洗滌兩次，56℃干燥后,可作為PCR反應(yīng)的模板。

1.2.3 PCR

1.2.3.1 PCR引物：引物序列是根據(jù)編碼耐熱核酸酶基因設(shè)計(jì)，由大連寶生物公司合成[7]。上游引物序列為(5’-3’)CGATTGATGGTGATACGGTT 279bp引物序列(5’-3’)為AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC。

1.2.3.2 PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系50 μl。包括25 μl Premix Taq預(yù)混液,1 μl 20 μmol正向引物，1 μl 20 μmol反向引物，去離子水23 μl。陽性對(duì)照：取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌，10 000×g離心10 min,用去離子水洗滌兩次，然后以10 000×g離心10 min，加100 μl去離子水煮沸10 min,14 000×g離心10 min，取2 μl上清液作為模板，加入反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果作為陽性對(duì)照。陰性對(duì)照：取2 μl去離子水代替模板，加入反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，作為陰性對(duì)照。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增程序：PCR反應(yīng)采用冷啟動(dòng)。94℃預(yù)變性4 min，再按94℃ 1 min，58℃ 0.5 min，72℃ 1.5 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸3.5 min。

1.2.3.4 電泳檢測(cè)：取10 μl PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并成像。

2 結(jié)果

2.1 人工污染的樣品檢測(cè)結(jié)果 本研究能直接從人工污染的含有102cfu/ml金黃色葡萄球菌的糞便標(biāo)本中提取金黃色葡萄球菌的DNA。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，成功的檢測(cè)出了人工污染的糞便標(biāo)本中的金黃色葡萄球菌。由圖可知檢出限是102cfu/ml。見圖1。

圖1 糞便中金黃色葡萄球菌PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

糞便標(biāo)本主要成分是一些食物殘?jiān)@些抑制因子的存在大大降低了PCR檢測(cè)的靈敏度，因而，限制了PCR方法在臨床檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。而FTA 濾膜的應(yīng)用，成功解決了這一問題，F(xiàn)TA 卡是將變性劑和螯合劑滲透在纖維基質(zhì)上，當(dāng)捕捉到細(xì)胞后能自動(dòng)將其裂解，DNA吸附在FTA 卡上，通過緩沖液洗滌，去除樣品中的其他成分，而吸附了DNA的FTA 卡可直接作為模板用于PCR反應(yīng)。這一方法，為PCR廣泛應(yīng)用于食源性致病菌引起的食物中毒快速檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)，使之真正應(yīng)用于臨床檢測(cè)成為可能。

目前國內(nèi)外采用的PCR方法檢測(cè)致病菌一般都需要進(jìn)行前增菌，雖然能提高檢測(cè)的靈敏度，但相應(yīng)的增加了檢測(cè)的時(shí)間，一般延長12～24 h。本試驗(yàn)采用FTA濾膜直接提取DNA模板，無需增菌，方法操作簡(jiǎn)便、快速，有效避免了工作人員在處理標(biāo)本時(shí)可能造成的感染。

1 Keith AL,Palmer AO,Leroy K.Improved template preparation for PCR assay for etection of food-brone bacterial pathogens.Appl Environ Microbiol,2000,66:4539-4542.

2 付素蘭，劉景武.FTA卡在模板DNA制備中的應(yīng)用研究.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18:1124-1125,1150.

3 匡金枝,聶同鋼.FTA-DNA直接提取法的研究與應(yīng)用.中國法醫(yī)學(xué)雜志,2008,23:108-110.

4 魯巧云,余進(jìn).FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鑒定中的應(yīng)用.中國真菌學(xué)雜志,2010,5:137-141.

5 Lois CT，Michelle T，Karl R.Automated forensic DNA purification optimized for FTA card punches and identifiler STR-based PCR analysis.Journal of the Association for Laboratory Automation,2005,10:183-191.

6 Palmer AO，Keith AL.Extraction-Free,filter-based template preparation for rapid and sensitive PCR detection of pathogenic parasitic protozoa.J Clin Microbiol,2000,38:2271-2277.

7 Kim CH,Khan M,Morin DE，et al.Optimization of the PCR for detection of Staphylococcus aureus nuc gene in bovine milk.J Dairy Sci,2001,84:74-83.

AnnewtemplatepreparationmethodforrapidandsensitivePCRdetectionofStaphylococcusaureusinfeces

FUSulan,LIUJingwu,SUNWenze.TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo establish an new template preparation method for rapid and sensitive PCR detection of Staphylococcus aureus in feces.MethodsFTA filter membrane was used to extract DNA in Staphylococcus aureus from artificially contaminated feces.Primers targeting the thermostable nuclease gene (nuc) were used to amplify a 279 bp DNA fragment which was confirmed by DNA sequencing.ResultsApplication of FTA filter membrane could effectively extract DNA template and removed PCR inhibitive factor in specimens.In the detection of Staphylococcus aureus from artificially contaminated feces by PCR,the detection limit was 102cfu/ml,which could be finished within 6 hours.ConclusionPCR amplification using FTA filter membrane provides a faster and more sensitive method of detecting Staphylococcus aureus in feces.At the same time,which establishes a technological platform for rapid detection of foodborne pathogenic bacteria.

PCR；feces；Staphylococcus aureus；FTA filter membrane

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.09.005

050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科

R 446.13

A

1002-7386(2014)09-1295-03

2013-10-30)