子癇前期患者胎盤組織中LIF和EGF的表達和意義

衛艷芬 王健

·論著·

子癇前期患者胎盤組織中LIF和EGF的表達和意義

衛艷芬 王健

目的測定白血病抑制因子(LIF)和表皮生長因子(EGF)在子癇前期患者胎盤組織中的表達變化，探討兩者在子癇前期發病過程中的作用。方法對38例正常的孕婦(對照組)和46例子癇前期的患者(其中輕度子癇前期的患者26例，重度子癇前期的患者20例)的胎盤組織中LIF和EGF的表達水平采用免疫化學組織技術-鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接法(SP法)進行組織學定位以及半定量分析。結果3組孕婦的胎盤組織中LIF和EGF都呈現陽性表達,在滋養細胞胞質中主要呈現陽性染色,而在細胞胞核中卻無明顯著色。而且按照正常對照組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組的順序其兩者在胎盤組織的染色強度及范圍依次減弱；其兩者在胎盤組織中的表達水平也依次降低。在輕度子癇前期組和重度子癇前期組中LIF的表達分別與正常對照組中LIF的表達比較都有明顯的降低(P<0.01)，并且隨著病情逐漸加重，LIF的表達也逐漸呈下降趨勢。但是比較輕度子癇前期組和重度子癇前期組，差異無統計學意義(P>0.05)。在子癇前期組中EGF的表達和在正常對照組中EGF的表達，進行比較其明顯降低(P<0.01)，并且隨著病情逐漸加重，EGF的表達也逐漸呈下降趨勢。且按照正常對照組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組的順序其表達水平呈依次降低(P<0.01)；而比較輕度子癇前期組和重度子癇前期組，差異無統計學意義(P>0.05)。經過采用pearson相關分析，在子癇前期組中LIF和EGF的表達量相關系數為+0.76，呈正相關(P<0.05)。結論LIF和EGF二者對維持正常妊娠起到了一定的保護作用。LIF與EGF在子癇前期患者胎盤組織中的表達下降，使滋養細胞的浸潤能力受到了影響，兩者共同參與了子癇前期的發病的過程。

白血病抑制因子；表皮生長因子；子癇前期；胎盤組織；妊娠期高血壓疾病

子癇前期/子癇發生于妊娠中晚期、分娩期及產后早期，它歸屬于妊娠期高血壓疾病，是在妊娠期發生的疾病中具有特征性的疾病之一，孕婦和圍生兒的發病率和病死率升高的主要原因就是由其導致的。高血壓、蛋白尿及其他全身系統性的紊亂為它的主要表現，而以全身抽搐為特征的子癇是疾病的終期階段。它的病因和發病機制迄今為止還沒有正確的結輪，目前認為,可能與它的發病有關的因素有胎盤淺著床、免疫因素、遺傳因素、血管內皮損傷、營養失調等等。本文通過對白血病抑制因子(leukem ia inhibitory factor,LIF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)在正常妊娠組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組患者的胎盤組織中的表達進行組織學定位及半定量分析,探討LIF和EGF與子癇前期發病的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇 2009年5月至2010年10月在我院產科84例剖宮產分娩的孕婦作為研究的對象,其診斷及分類標準參考全國統一主編的教材《婦產科學》(第七版)[1]。其中選擇38例正常妊娠孕婦(是由于胎位不正或骨盆狹窄或羊水過少或三者都有等指征進行剖宮產分娩的)作為正常對照組,平均年齡(27.9±1.6)歲；平均孕周(38.8±1.5)周，46例子癇前期組孕婦,平均年齡(29.1±2.5)歲；平均孕周(37.6±1.5)周,其中有26例輕度子癇前期，20例重度子癇前期。3組病例經調查都沒有原發性高血壓、糖尿病、肝炎和結核及癌癥等急性慢性病史,且都是單胎活嬰。

1.2 標本與采集 孕婦在進行剖宮產時,各組都在胎盤娩出之后立刻在胎盤母體的正中面在保持無菌的狀態下切取大小約為1 cm×1 cm×1 cm的胎盤組織，必須避開鈣化灶和機化灶以及壞死灶，且更要避開出血區。先沖洗后固定——所有標本用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈之后，用中性甲醛固定24～48 h， 然后進行常規脫水處理，最后用石蠟包埋起來，制作成石蠟包塊。

1.3 組化免疫與半定量分析 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接法(SP法)。用PBS(磷酸緩沖液)對抗陰性對照,嚴格按試劑盒說明書進行操作。光鏡下細胞內在排除非特異性著色情況下出現棕黃色顆粒表明LIF和EGF表達陽性。然后進行半定量分析，按照Fromowitz等[2]免疫組化綜合計分法盡心分析。

1.4 判定方法 陽性細胞以出現明顯的棕黃色顆粒為特征, 陰性細胞以沒有著色或與背景顏色一致為特征;隨機抽取10個高倍視野,計算滋養細胞的總數和陽性細胞的總數，結果得出陽性細胞百分率以及計分。0分代表沒有陽性細胞，1分代表陽性細胞百分率為1%～25%,2分代表陽性細胞百分率占26%～49%,3分代表陽性細胞百分率為≥50%;根據陽性細胞在細胞膜或者細胞漿中的著色強度計數得分, 0分為陰性，1分為淺黃色，2分為棕黃色， 3分為棕褐色;最后把兩者分數相加，結果0～1分代表(-)；2分代表(+)；3～4分代表(++)；5～6分代表(+++)。把(-)、(+)表現看作低表達，把(++)、(+++)表現看作高表達。

2 結果

2.1 3組臨床特征 年齡、分娩孕周和孕次以及產次上這3組孕婦差異沒有統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組臨床特征

組別年齡(歲)分娩孕周(周)孕次(次)產次(次)正常對照組(n=38)28.0±1.638.86±1.542.4±1.21.3±0.5輕度子癇前期組(n=26)29.1±2.537.63±1.492.3±0.21.4±0.3重度子癇前期組(n=20)28.4±1.937.44±1.282.8±0.81.2±0.4

2.2 LIF和EGF在3組實驗對象胎盤組織中的表達 比較子癇前期組與正常對照組，LIF的表達明顯降低(P<0.01)，且隨著病情越來越重，LIF表達也逐漸下降。而比較輕度子癇前期組和重度子癇前期組(P>0.05)。均且按照正常對照組、輕度子癇前期組、重度子癇前期組的順序，EGF在各胎盤組織中的表達水平也依次降低(P<0.01)。比較子癇前期組與正常對照組,EGF表達水平也明顯降低(P<0.01)。見表2。

表2 3組胎盤組織中LIF和EGF的表達結果比較表 例(%)

注：與正常妊娠組比較，*P<0.01；與輕度子癇前期比較，#P<0.01

2.3 LIF的表達與EGF的表達二者在胎盤組織中表達的關系 通過pearson相關分析,子癇前期組LIF的表達量和EGF的表達量呈正相關(r=0.76，P<0.05)。

3 討論

子癇前期/子癇的病因及發病機制迄今為止還沒有明確的說法，目前比較公認的觀點為,基因的特有遺傳背景使子癇前期/子癇的發生易感性增加了，螺旋小動脈發生重鑄過程的障礙迫使胎盤缺血和缺氧、以及導致激活和損傷內皮細胞。損傷的血管內皮細胞使得機體凝血與纖溶平衡關系失去調控，血管活性物質得以釋放,發生血管痙攣性的收縮以及血壓的升高,最終導致妊娠期高血壓疾病的發生。子癇前期發生的中心環節就是內皮細胞的損傷。

LIF是一種分泌型糖蛋白,其具有種生物學功能。隨著在人類生殖方面研究的深入,LIF被學者認為是母體和胎兒界面產生的具有極其重要調節作用的細胞因子之一，在妊娠生理過程中它也起著舉足輕重的作用,并且發現妊娠的全過程都有LIF的作用貫穿其中[3]。有足夠的證據表明，LIF是一個存在于子宮內膜中潛在的調節因子,在人類的生殖活動中可能扮演著關鍵的角色[4]，滋養細胞的浸潤能力被LIF通過多種途徑影響著,但這對妊娠的維持非常有利:比如基質金屬蛋白酶及尿激酶型纖溶酶原激活劑的活性能被它所增強,一種稱之為血管舒張刺激磷蛋白(VASP)的表達能被它誘導所增強,局部黏附形成并增加線性機動蛋白的聚集也可能是其通過誘導VASP的表達而導致的, 從而滋養細胞的運動和遷移得以調節[5]，滋養細胞的侵入隨著被促進；影響滋養細胞的發育和分化也受上調黏附因子整合素的表達的影響(整合素α1能介入導致胚胎的層粘連蛋白及纖連蛋白與蛻膜細胞互相發生作用)，從而促使滋養細胞的浸潤、遷移和生長速度加快。而它如果分泌或調控不正常，滋養細胞的浸潤能力就會受其影響，就會導致病理妊娠發生的可能。在妊娠早期，妊娠高血壓疾病的病理和生理基礎發生,通過一連串的連鎖效應，發病在妊娠中、晚期，被學者認為此過程是不完全自然流產的一種形式,其中妊娠期高血壓疾病發病的關鍵正是由于早期滋養細胞浸潤能力的下降所導致的[6]。在懷孕早期母體和胎盤免疫耐受性發生改變阻礙了子宮螺旋小動脈的生理重鑄過程, 減少了胎盤的灌注血流量,導致滋養細胞缺血缺氧,從而滋養細胞的浸潤能力受到了影響，并且使其受損相當嚴重，導致胎盤淺著床的形成。形成妊娠高血壓疾病的中心環節是滋養細胞浸潤能力的不足導致阻礙了子宮螺旋動脈的重塑,滋養細胞的浸潤深度及其數量與妊娠高血壓疾病發病有密切關系[7]。LIF可能參加了這個過程,此研究結果表明: 比較輕度子癇前期組與重度子癇前期組,LIF在胎盤組織中的表達表達稍微有點降低,但沒有統計學差異(P>0.05),這可以推測從正常妊娠到子癇前期發病中間有個過程即可能經過輕度子癇前期組的過渡狀態,說明患者尚處于發病的初級階段,機體還有能力代償調節,即還處于 “量變”階段。LIF在子癇前期組胎盤組織中的表達量與正常對照組比較明顯降低(P<0.01)，并且隨著病情的一步步的加重,LIF的表達量也一步步的下降;表明LIF在子癇前期患者胎盤組織中的表達進一步減弱,可能導致進一步降低滋養細胞的浸潤能力, 阻礙了子宮螺旋小動脈的生理重鑄過程, 隨之進一步減少了胎盤的血流灌注,滋養細胞的缺血缺氧也進一步加重了,從而引發了“量”到 “質”的變化,最后終于導致胎盤淺著床的形成, 共同參與了子癇前期的發病機制[8]。

EGF是一要的細胞生長調節因子，在妊娠期間, EGF存在于孕婦及胎兒許多組織和血漿、尿、以及羊水中，其釋放受神經因素和激素等多種因素的影響。且它必須與其受體(EGFR)結合才能發揮正常的生物學效應,兩者具有高度特異性以及親和力,種重受體二聚體的形成,細胞生長與分化被其激活和調節，其刺激細胞增生和分化為其最主要的作用表現為。EFG作為胎盤分泌的生長因子, 影響著滋養細胞的遷移和侵蝕，此過程是通過增強滋養細胞表面的整合素α1、α2的表達實現的,滋養細胞低表達水平的EFGR使EFG不能有效正常的發揮其生物學作用,滋養細胞增殖、分化和侵入受到了嚴重影響[9]。在正常細胞分裂增殖和惡性轉化中EGF和EGFR起著非常重要的作用[10]。部分細胞的分化及已分化細胞的功能因其缺乏時可受到嚴重影響。在妊娠期間EGF及其受體含量均增加,在胎兒、胎盤的生長發育過程中起著重要的作用,其主要作用有:調控著床、影響胎盤功能、促進滋養細胞合成分泌及分化等以及參與病理妊娠(如早期流產、胎盤發育不良、妊娠期高血壓疾病等)。本研究結果表明：EGF在子癇前期患者中的表達水平顯著低于正常孕婦,表明EGF與子癇前期發生和發展有關。由于EGF的低水平表達使滋養細胞表面整合素的表達受到了影響,從而滋養細胞的遷移和侵蝕也受到了影響,使滋養細胞分化不良, 阻礙了螺旋動脈的重鑄過程,子宮胎盤的血流循環發生障礙,從而導致了子癇前期的發生。滋養細胞由于EGF的低水平表達導致了過度凋亡,從而導致妊娠期高血壓疾病時的胎盤淺著床的形成[11]。EGF的表達隨著病情的加重其水平進一步降低。綜上所述,EGF在胎盤組織中的表達水平按照正常對照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組的過程依次降低，說明EGF在子癇前期的發生及發展過程中起著非常重要作用,檢測EGF在胎盤組織中的表達水平可作為判定病情變化的重要指標。

LIF與EGF是人體內兩個有重要影響力的生長因子,二者分泌及發揮生理作用互相影響，二者參與子癇前期的發病都是通過影響滋養細胞的浸潤能力實現的,本研究發現:在子癇前期患者胎盤組織中LIF的表達和EGF的表達呈正相關 , 相關系數為+0.76，提示隨著胎盤組織中LIF表達的降低EGF的含量也隨著降低。研究表明在妊娠過程中，LIF通過增強黏附因子整合素的表達，整合素α1、α2能介導胚胎的層粘連蛋白和纖連蛋白與蛻膜細胞相互作用，促進滋養細胞浸潤、遷移和生長。滋養細胞表面整合素α1、α2的表達增強，促進了EGF的分泌。子癇前期的胎盤組織中由于LIF的表達降低,使得整合素表達減弱，導致了EGF的表達下降，滋養細胞的遷移和侵蝕受到了嚴重影響。LIF和EGF在子癇前期患者胎盤組織中表達的降低，可能通過影響滋養細胞的浸潤能力進而影響了胎盤的發育,從而導致胎盤淺著床的形成，內皮細胞受到嚴重損傷，共同參與了子癇前期發病過程。

通過以上所綜述,表明妊娠期高血壓疾病發病的重要特征有三個方面：功能紊亂的滋養細胞, 重鑄受阻的螺旋動脈,子宮-胎盤的血流障礙[12]。這一病理過程其中就有白血病抑制因子及表皮生長因子的參與,這兩種因子在妊娠期高血壓疾病的發病中起著及其重要的作用, 研究二者的相關性,對于從分子水平方面分析在子癇前期發病中胎盤的內分泌功能的作用很有幫助。,今后研究子癇前期發病的一個主要方向就是對二者的進一步研究。提供了預防、診斷和治療子癇前期的新的臨床思路及治療手段 ,但還有待于進一步深入的研究其具體的作用機制和原理。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.09.009

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王健，050051 河北醫科大學第三醫院婦產科；

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2013-10-29)