宮頸癌細胞周期素表達及意義

陳小燕 許三鵬 陶德定 李小蘭 于世英

·論著·

宮頸癌細胞周期素表達及意義

陳小燕 許三鵬 陶德定 李小蘭 于世英

目的研究宮頸癌組織中4種細胞周期素(cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE)的表達，探討4種cyclins與放射敏感性之間的關系。方法流式細胞術檢測42例宮頸癌組織的4種cyclins。每周測量宮頸局部腫瘤大小，計算其消退50%時間(T0.5)。分析4種cyclins表達與放射敏感性(T0.5)的關系。結果宮頸癌組織cyclinA、cyclinB、cyclinD1、cyclinE均有不同程度過度表達，其陽性表達率分別為64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%。cyclinA、cyclinE陽性的腫瘤其宮頸局部腫瘤消退50% T0.5值小，腫瘤消退快，放射敏感性好，差異有顯著意義(P=0.033，P=0.023)。結論宮頸癌組織4種cyclins均過度表達。宮頸癌組織cyclinA、E的表達可作為放射敏感性的預測指標。

宮頸癌；細胞周期素；放射敏感性；流式細胞術

細胞周期調控機制破壞是腫瘤共同存在的普遍規律。細胞周期素(cyclin)作為細胞周期正向調控因素，在細胞周期事件的調控過程中起著關鍵作用，其表達規律的改變可能導致細胞的增殖失控和惡性轉化，是許多癌基因、抑癌基因作用的主要匯聚點[1]。隨著人們對細胞周期分子機制研究的進展，發現細胞周期是一系列cyclin共同調節的，其調控是一個動態的連續過程，因此，單一cyclin的變化不能全面反映其在細胞周期中的調控作用。本實驗采用流式細胞術對4種cyclins表達水平進行半定量，分析它們與放射敏感性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年7月至2011年3月在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院就診的初治宮頸癌患者42例，治療前均經病理學證實，均接受根治性放射治療(體外照射加腔內治療)。年齡32～65歲,平均45.7歲。其中鱗癌38例，腺癌4例。FIGO(國際婦產聯盟)臨床分期：Ⅱa期2例,Ⅱb期10例，Ⅲa期3例，Ⅲb期26例，Ⅳa期1例。放療前和放療10Gy后各取宮頸癌組織，制備成單細胞混懸液，80%乙醇固定于-20℃。收集7例行子宮切除術的非宮頸癌患者的正常宮頸組織作為正常對照。其中子宮肌瘤4例，卵巢囊腫2例，卵巢癌1例。

1.2 實驗方法 表達cyclinA、cyclinB、cyclinE的Molt4細胞作為陽性對照。4種cyclin單克隆抗體(Pharmigen公司)分別加入細胞管中，4℃孵育過夜。IgG同型特異性抗體(Sigma公司)替代cyclin單抗作為陰性對照。PBS洗兩遍。加入FITC- IgG熒光二抗(DAKO公司)，室溫避光放置30 min。每管加入500 μl PBS,10 μl PI,10 μl Rnase，室溫避光放置30 min。經雙熒光標記的細胞用FACSORT流式細胞儀進行檢測，獲得cyclin/DNA雙參數圖像。每周1次測量宮頸局部腫瘤大小。記錄放療前腫瘤最大直徑。計算宮頸局部腫瘤消退50%所需的時間(T0.5)，以天計算。

1.3 結果判斷 結果用Cellquest軟件處理分析，以陰性對照為參照，高于陰性對照即為陽性表達，獲得cyclin值，以陽性百分數表示。

1.4 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織細胞cyclinA、cyclinB、cyclinD1及cyclinE均有不同程度過度表達，其陽性表達率分別為64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%。正常宮頸組織cyclinA、cyclinB、cyclinD1 和cyclinE均無表達。見圖1。

2.2 宮頸癌組織cyclins表達與臨床分期的關系 cyclinA、cyclinE值在不同臨床分期之間存在顯著差異(P=0.001；P=0.001)，并且隨著臨床分期增高，cyclinA、cyclinE值呈現逐漸下降趨勢(r=-0.506,P=0.006；r=-0.440,P=0.022)。cyclinB、cyclinD1與臨床分期無明顯相關性(P=0.672，P=0.069)。見圖2。

2.3 宮頸局部腫瘤消退50%的T0.5值與4種cyclins表達的關系 cyclinA、cyclinE陽性的腫瘤其宮頸局部腫瘤消退50%的T0.5值小，腫瘤消退快，放射敏感性好(P=0.033；P=0.023)。cyclinB、D1與T0.5之間無相關性(P=0.255，P=0.894 )。見表1。

圖1 cyclins的表達

圖2 cyclins表達與FIGO分期的關系

表1 cyclins表達與T0.5的關系

3 討論

目前在哺乳動物細胞中發現了20多種cyclin。對細胞周期有明確調控作用的主要是cyclinA、B、D1～3和E。cyclins對細胞周期的調控主要表現在G1和M期。G1期cyclins主要包括cyclinD1、E。cyclinD1在G1早期表達，是細胞周期啟動因子,它與CDK4結合使之活化，對Rb磷酸化，使細胞通過限制點(R點)進入S期。cyclinE主要在G1晚期發揮作用,是G1和S期轉換的限速因子。CyclinE-CDK2復合物能使Rb因磷酸化而失活，使細胞從G1期進入S期。M期cyclin主要有cyclinA和B，在G2和M期交界處發揮作用，誘導細胞分裂。Cyclin的這種關卡機制保證分裂產生的子代細胞的DNA完整性。如果其失調，使本來應停止增殖或發生凋亡的細胞的DNA損傷或復制錯誤未能及時糾正，細胞就會帶著錯誤信息進入周期循環而造成惡變[2]。

體外和多種人體腫瘤中均已觀察到無限制表達的cyclin的致癌作用。50%的乳腺癌以及食管癌，頭頸鱗癌中均觀察到cyclinD1的過度表達[3]。有人對宮頸鱗狀細胞癌組織進行cyclinE檢測，并與宮頸不典型增生和正常宮頸組織進行比較，結果發現正常宮頸組織無cyclinE蛋白表達，宮頸不典型增生組織有少數表達，而在宮頸鱗狀細胞癌中有58.52%表達[4]。本研究的結果顯示，宮頸癌組織中cyclinA、B、D1、E的表達較正常組織明顯升高，其陽性表達率分別為64.2%、83.4%、57.0% 和69.0%，正常宮頸組織中cyclinA、B、D1、E均無表達，與文獻報道一致。說明cyclin過表達在宮頸癌的發生發展中起作用。

本研究還發現，宮頸癌的臨床分期與 cyclinA、E的值之間存在顯著差異(P<0.01 )，并呈負相關(r=-0.506，P=0.006；r=-0.440，P=0.022 )，即隨著臨床分期的升高，cyclinA、E的值呈下降趨勢，與文獻報道[5]一致，由此表明在腫瘤進展過程中cyclinA、E的表達并非呈直線上升，而是呈先上升再下降的趨勢。在腫瘤發生的早期，細胞周期機制破壞的程度較輕，表現為細胞周期檢測點的部分破壞，細胞周期仍須靠高表達cyclin的驅動使細胞越過檢測點，完成在正常細胞周期調控機制下難以實現的腫瘤細胞克隆的增殖；而在腫瘤的晚期細胞周期檢測點可能已完全被眾多異常基因累積的共同作用所破壞，細胞在無檢測的周期中運行，細胞周期易于啟動，因而cyclin低表達。

關于cyclin與放射敏感性的關系的研究較少，且結論不一。Miyata等[6]報道在食管鱗狀細胞癌中，用免疫組化方法檢測cyclinD1和cyclinB1，放射敏感組

與放射耐受組的表達無顯著差異；Shintan在41例口腔鱗癌和9株口腔鱗癌細胞系中檢測到cyclinD1的過表達與放射敏感性的增加相關[7]；而Milas的研究表明，經15 Gy照射后，在高表達cyclinD1的SCC-VII放射抗拒腫瘤細胞系中未能誘導顯著的凋亡和PCAN陽性細胞數變化，而在低表達cyclinD1的Oca-I細胞系中誘導出顯著的凋亡和增殖細胞的減少[8]。本研究發現cyclinA、cyclinE的陽性表達率與宮頸局部腫瘤消退50%的T0.5值之間有顯著差異，cyclinA、cyclinE表達陽性者其宮頸局部腫瘤消退50%的時間T0.5較短，對放療的反應好，放射敏感，表達陰性者其T0.5較長，對放療的反應差，放射敏感性差。

本實驗通過檢測宮頸癌組織4種cyclin，研究其與腫瘤消退50%T0.5、臨床分期等因素的關系，發現宮頸癌組織4種cyclins均呈過度表達，cyclinA、cyclinE的過度表達與宮頸癌的惡性生物學行為及放射敏感性相關，可作為放射敏感性的預測指標。

1 Zucca E，Nigg EA.Cell cycle regulation and the function of cancer genes.Ann Oncol，1995，136: 961-964.

2 Qin J，Li L.Molecular anatomy of the DNA damage and replication checkpoints.Radiat Res，2003，159: 139-148.

3 Yu Q，Geng Y，Sicinski P.Specific protection against breast cancers by cyclinD1 ablation.Nature，2001，411:1017-1021.

4 Duman Schee IM，Weng L，Xin S，et al.Hedgehog regulates cell growth and proliferation by inducing cyclinD and cyclinE.Nature，2002，417:299-304.

5 Cho NH，Kim YT，Kim JW.Correlation between G1 cyclins and HPV in uterin cervix.Int J Gynecol Pathol，1997，73:339-347.

6 Miyata H，Doki Y，Yamamoto H，et al.Overexpression of CDC25B overrides radiation-induced G2-M arrest and results in increased apoptosis in esophageal cancer cells.Cancer Res，2001，61:3188-3193.

7 Shintani S，Mihara M，Ueyama Y，et al.Cyclin D1 overexpression associates with radiosensitivity in oral squamous cell.Int J Cancer，2001，96:159-165.

8 Milas L，Akimoto T，Hunter NR，et al.Relationship between cyclin D1 expression and poor radioresponse of murine carcinomas.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2002，52:514-521.

Expressionandsignificanceofcyclinsincervicalcarcinoma

CHENXiaoyan,XUSanpeng,TAODeding,etal.DepartmentofOncology,ShunyiDistrictHospitalofBeijing,Beijing101300,China

ObjectiveTo investigate the expression of human major cyclins (cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE),and to explore the correlation between their expression and radiosensitivity in cervical carcinoma.MethodsThe expression levels of the four kinds of cyclins were detected by flow cytometry in 42 cases of local advanced cervical carcinoma tissues before radiotherapy and after treatment with 10 Gy radiation.The time for the tumor to diminish a half (T0.5) was calculated every week.The correlation between the expression of the four kinds of cyclins and radiosensitivity (T0.5) was analyzed.ResultsThe positive expression rates of cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE in cervical carcinoma were 64.2%,83.4%,57.0%,69.0%,respectively.The T0.5 value in tumors with positive cyclinA and cyclinE was significantly lower (P<0.05),moreover their radiosensitivities were better.ConclusionThe overexpression of cyclinA,cyclinB,cyclinD1,cyclinE exists in cervical carcinoma,which can be used as prediction index for evaluating radiosensitivity in cervical carcinoma.

cervical carcinoma; cyclins; radiosensitivity; flow cytometry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.002

101300 北京市順義區醫院腫瘤科

于世英，101300 北京市順義區醫院腫瘤科；

E-mail：syyu@tjh.tjmu.edu.cn

R 737.33

A

1002-7386(2014)10-1448-03

2013-11-20)