p-Akt和CDK2的表達與非小細胞肺癌新輔助化療的相關性研究

薛英杰 谷麗平

·論著·

p-Akt和CDK2的表達與非小細胞肺癌新輔助化療的相關性研究

薛英杰 谷麗平

目的探討不同類型癌癥中蛋白激酶B(Akt，又稱PKB)、周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK2)與非小細胞肺癌新輔助化療之間的相關關系，為非小細胞肺癌的預后判斷及治療提供依據和指導。方法收集2010年9月至2012年6月收治的120例非小細胞肺癌患者中選出80例非小細胞肺癌患者，以新輔助化療前穿刺活檢病理組織為對照組，試驗組為順鉑聯合紫杉醇組， 80例患者均為進行新輔助化療2周期后再行手術的患者。病理標本采用免疫組織化學方法(SP法)及逆轉錄PCR法檢測pAkt和CDK2在新輔助化療前及手術后的表達變化情況。進一步分析AKT、CDK2的表達與非小細胞肺癌化療效果之間的相關性。結果新輔助化療能有效殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤組織的生長，使腫瘤組織縮小，提高臨床手術的切除率。免疫組織化學SP法染色表明，新輔助化療二周期順鉑聯合紫杉醇組P-Akt表達均低于新輔助化療前(P<0.05)。提示pAkt、CDK2表達與化療療程負相關，隨化療時間的延長，pAkt、CDK2表達降低(P<0.05)。逆轉錄PCR法檢測Akt與CDK基因的表達新輔助化療二周期順鉑聯合紫杉醇組AktRNA的表達低于新輔助化療前，CDK2RNA的表達均明顯低于新輔助化療前(P<0.05)。提示AktRNA、CDK2RNA的表達與化療療程負相關，隨化療時間的延長，AktRNA、CDK2RNA的表達降低。結論新輔助化療能有效殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤組織的生長，使腫瘤組織縮小，提高臨床手術的切除率。AKT和CDK2作為參與非小細胞肺癌發生發展的重要基因。新輔助化療能有效降低腫瘤基因AKT和CDK2的RNA及蛋白表達，且隨化療療程延長及患者聯合化療的應用，AKT基因表達降低，CDK2基因表達的降低更為明顯。

p-Akt，CDK；非小細胞肺癌；新輔助化療

近十年來，肺癌的發病率及死亡率都位居全球之首，世界衛生組織預測，我國將成為世界第一肺癌大國，此外，肺癌尚缺乏有效的早診早治手段，總的5年生存率低于10%。因此，無論從發病率、死亡率還是預后看，肺癌都是嚴重威脅人民健康和生命的疾病，已經是我國第一大癌癥，成為我國新世紀癌癥防治的難中之難，重中之重。在臨床工作中，肺癌的病理類型以非小細胞肺癌居多，而小細胞肺癌較少。在非小細胞肺癌中鱗癌和腺癌多見。肺癌的起病隱匿，許多患者在診斷明確時常發生淋巴結轉移。前人研究表明，對于中晚期非小細胞肺癌患者，起初不能手術切除的患者經過新輔助化療后腫瘤組織縮小，可進行手術切除治療。提高了患者進行手術切除的幾率。從而提高患者的生存率和治療有效率。本試驗通過在手術前后分別取腫瘤組織標本研究新輔助化療對患者病理組織中蛋白激酶B(Akt又稱PKB)、周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK2)的表達結果進行比較和分析，為非小細胞肺癌的臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院病理科2010年9月至2012年6月非小細胞肺癌患者石蠟包埋組織160塊，其中包括80例化療前和80例術后腫瘤組織標本石蠟包埋組織。80例非小細胞肺癌患者，均為男性吸煙患者。年齡40～70歲，平均年齡55歲，中位年齡62歲，分期為Ⅲ期。標本的選取有可對照性，取材腫瘤大小一樣，先做新輔助化療使腫瘤縮小后有利于手術的開展。

1.2 分組及化療 選取鱗癌患者40例，腺癌患者40例。以新輔助化療前穿刺活檢病理組織為對照組，順鉑聯合紫杉醇組為試驗組，其中順鉑按70 mg/m2，紫杉醇按175 mg/m2計算使用。80例患者均為進行新輔助化療2周期后再行手術。

1.3 新輔助化療方法 (1)新輔助化療前評估患者在入選前詳細詢問病史并進行細致的查體。然后進行分期檢查，包括頭部MRI、胸部CT、腹部彩超、淺表淋巴結彩超、全身骨掃描。實驗室檢查包括血、尿、便常規，肝腎功、血糖、電解質、腫瘤標志物檢查。(2)新輔助化療后療效及評價方法：療效：兩個最大垂徑乘積變化；CR：全部病灶消失，至少維持4周；PR：縮小至少50%，至少維持4周；NC/SD：介于PR 和PD之間；PD：增加超過25%,或出現新病灶。

1.4 試驗方法

1.4.1 免疫組織化學SP法染色：對非小細胞肺癌患者p-AKT和CDK2采取免疫組織化學法染色，即采用抗體與抗原特異性結合顯色的方法，檢測CDK2及p-AKT蛋白質表達狀況。判斷標準：免疫組織化學結果應用IPP圖文分析軟件分析。細胞胞漿中有棕黃色顆粒為陽性信號，每個標本切片取10個高倍視野(400倍),綜合陽性面積和染色深度計算陽性區域的光密度值(IOD)，以各組的均值進行比較[2]。

1.4.2 另一種方法采用逆轉錄PCR法檢測Akt與CDK基因的表。

2 結果

2.1 新輔助化療對非小細胞肺癌療效的觀察 80例病例中2周期化療后完全緩解為3.75%(3/80)；部分緩解為35.00%(28/80)；臨床穩定為42.50%(34/80)；臨床進展為18.75%(15/80)。經新輔助化療后部分患者的腫瘤體積變小，可順利進行手術治療。

2.2 新輔助化療對非小細胞肺癌p-AKT蛋白表達的影響 免疫組織化學SP法染色表明，P-AKT主要在胞漿內表達，細胞核內也有少量表達。表現為出現棕黃色顆粒。新輔助化療二周期順鉑聯合紫杉醇組P-Akt表達(0.59±0.09)均低于新輔助化療前(0.78±0.10)(P<0.05)。提示pAkt表達與化療療程負相關，隨化療時間的延長，pAkt表達降低(P<0.05)。

2.3 新輔助化療對非小細胞肺癌CDK2蛋白表達的影響 免疫組織化學SP法染色表明，CDK2主要在胞漿內表達，細胞核內也有少量表達。新輔助化療二周期順鉑聯合紫杉醇組CDK2表達(0.37±0.06)均明顯低于新輔助化療前(0.84±0.09)(P<0.05)。提示CDK2表達與化療療程負相關，隨化療時間的延長，CDK2表達降低(P<0.05)。

2.4 逆轉錄PCR法檢測Akt與CDK基因的表達 新輔助化療二周期順鉑聯合紫杉醇組AktRNA的表達均明顯低于新輔助化療前(P<0.05)。提示AktRNA的表達與化療療程負相關，隨化療時間的延長，AktRNA的表達降低(P<0.05)。新輔助化療二周期順鉑聯合紫杉醇組CDK2RNA的表達均明顯低于新輔助化療前。提示CDK2RNA的表達與化療療程負相關，隨化療時間的延長，CDK2RNA的表達降低(P<0.05)。

3 討論

近年來，大量研究表明AKT在肺癌信號通路中起重要的調控作用[1]。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidy linositol-3 kinase,PI-3K)可受多種生長因子激活，為生長因子家族的重要成員。活化的PI3K可以使PIP2變為PIP3，PIP3可以激活磷脂酰肌醇依賴性酶1(3'-phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)，后者可以使AKT活化。PI3K/AKT信號通路誘導細胞增殖和分化，避免發生細胞凋亡。絕大多數抗腫瘤藥物都是通過誘發腫瘤細胞凋亡，從而殺死腫瘤細胞。通過藥物降低AKT的活化水平能夠增加腫瘤細胞對于化療藥物的敏感性[2]。

基于AKT的分子結構設計選擇AKT抑制劑，主要分為如下三種：ATP競爭性抑制劑、PH結構抑制劑、變構抑制劑和底物類似物。GSK690693是一種ATP競爭性抑制劑，在低濃度時對AKT的3中亞型均可抑制，降低下游分子的磷酸化水平。并能增強RB1和FOX01/3的活性，從而抑制Myc和TFRC的活性。缺點是這種抑制劑對所有AGC家族蛋白質均有抑制作用，特異性不強。PH結構抑制劑：派立福新是一種烷基磷脂類抗癌藥物，降低AKT的磷酸化水平，從而抑制癌細胞及誘導凋亡，增加其他化療藥物的敏感性[4]。

Akt促進細胞侵襲和轉移。活化的AKT通過多種途徑調節內皮一氧化氮合成酶(endothelial NO synthase，eNOS)、MMP2及Ps6k等。eNOS促進血管內皮生長因子(VEGF)誘導細胞遷移[5]。

CDK2在細胞周期中作為正向調節因子，與細胞的演變、增殖、分化有關，是原癌基因的一種。CDK2蛋白的表達與淋巴結轉移有關。對宣威地區非小細胞肺癌研究表明CDK2在宣威地區的鱗癌和腺癌中的表達均高于正常的組織。且該蛋白與非小細胞肺癌臨床分期和組織分化程度無關(P>0.05)。CDK2的表達與P27kip1表達負相關(P<0.05)[6]。

本研究通過對80例非小細胞肺癌患者的病理切片進行免疫組化染色，觀察p-Akt、CDK表達和非小細胞肺癌化療之間的相關性。首先研究Ⅲ期鱗癌和腺癌患者在化療前穿刺組織的表達情況，然后研究2周期化療后p-Akt、CDK表達情況，并進行比較。

本研究中，我們觀察了新輔助化療前后所選病例病灶大小的變化，我們發現以上80例病例中， 2期化療后完全緩解為3.75%(3/80),部分緩解為35.00%(28/80),臨床穩定為30.00%(34/80)，臨床進展為18.75%(15/80)。經新輔助化療后一部分患者的腫瘤變小，順利的進行了手術治療。

然后，我們用免疫組織化學的檢測方法，檢測化療前、2周期化療后p-Akt、CDK表達水平，結果顯示P-Akt表達水平與患者化療藥物負相關。隨著化療藥物使用，AKT表達水平逐步降低。二者對比差異顯著。免疫組織化學SP法染色表明，CDK2主要在胞漿內表達，細胞核內也有少量表達。CDK2表達水平也與患者使用化療藥物呈負相關，隨著化療藥物的使用，CDK2表達水平降低，患者在化療前后表達水平有顯著差異。這說明使P-AKT表達水平降低，聯合化療是有效的。新輔助化療使腫瘤組織縮小后有利于手術的開展，從而提高手術的成功率及患者的治療有效率。

綜上所述， 新輔助化療能有效殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤組織的生長，使腫瘤組織縮小，提高臨床手術的切除率。AKT和CDK2作為參與非小細胞肺癌發生發展的重要基因。新輔助化療能有效降低腫瘤基因AKT和CDK2的RNA及蛋白表達，且隨化療療程延長及患者聯合化療的應用，AKT基因表達略降低，CDK2基因表達的降低明顯。

1 Carnero A.The PKB/AKT pathway in cancer.Curr Pharm Des,2010,16:34-44.

2 董自強,江克華,宋興福,等.抑制PI3K/AKT信號通路提高膀胱癌化療效果的實驗研究.實用醫學雜志,2012,28:181-184.

3 張頤，伍丹丹，席紅，等.新輔助化療對晚期卵巢漿乳癌組織PI3K、P-AKT、PTEN表達的影響及臨床意義探討.山東醫藥,2009，49：76-77.

4 繆小輝,宋勇,呂鏜峰,等.AKT2在非小細胞肺癌中的表達及預后意義.中國癌癥雜志,2011,21：396-399.

5 蒲絨,李為民,劉丹,等.AKT2及磷酸化AKT2在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義.四川大學學報(醫學版),2010,41:586-589.

6 金文虎,王達利,聶開瑜,等.增生性瘢痕成纖維細胞中CyclinD1，CDK2，CDK4作用及與細胞周期的相關性.中國組織工程研究,2012,16：4423-4426.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.10.014

073000 河北省定州市人民醫院腫瘤科(薛英杰);定州市人民醫院腎內、內分泌科(谷麗平)

R 734.2

A

1002-7386(2014)10-1478-03

2013-10-18)