食管鱗狀細(xì)胞癌組織中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達(dá)

郭艷麗，李穎霞，陳奎生，李晟磊，溫洪濤#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

食管鱗狀細(xì)胞癌組織中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達(dá)

郭艷麗1)，李穎霞1)，陳奎生2)，李晟磊2)，溫洪濤1)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052

#通訊作者，男，1968年2月生，博士，教授，研究方向：消化道腫瘤，E-mail：wenhongtao68@163.com

特異性泛素肽酶22；C-myc；Caspase-3；食管鱗狀細(xì)胞癌

目的：探討特異性泛素肽酶22(USP22)、C-myc和Caspase-3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法采用免疫組化SP法檢測45例食管鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管組織中USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達(dá)，分析三者與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。結(jié)果食管鱗狀細(xì)胞癌、癌旁不典型增生和正常食管組織中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的陽性表達(dá)率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.614、41.838和33.889，P<0.001)。食管鱗狀細(xì)胞癌組織中USP22、C-myc蛋白的表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及臨床分期有關(guān)(P<0.05)，Caspase-3蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)；USP22蛋白與C-myc蛋白表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)(rP=0.559,P<0.001)，兩者與Caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián)(rP=-0.468和-0.477,P<0.001)。結(jié)論USP22、C-myc高表達(dá)和Caspase-3低表達(dá)可能與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

食管癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，以鱗狀細(xì)胞癌多見，其發(fā)生是多階段、多因素、多基因共同作用的結(jié)果，研究其發(fā)病機(jī)制對食管癌的診斷及治療意義重大。特異性泛素肽酶22(ubiquitin-specific processingpeptidase 22，USP22)是一種去泛素化酶，也是新鑒定的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物之一，其在多種惡性腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，但在食管癌組織中的表達(dá)情況國內(nèi)尚無報告。C-myc是腫瘤干細(xì)胞因子相關(guān)信號傳導(dǎo)wnt通路重要成員之一，研究[1]表明其與USP22具有協(xié)同作用。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，其活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆階段[2]。該研究通過免疫組化方法檢測USP22、C-myc、Caspase-3蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌(食管鱗癌)組織中的表達(dá)，探討其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床診治及預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年1月至12月手術(shù)切除的食管鱗癌組織標(biāo)本45例，其中男28例，女17例；年齡 45～82歲，<60歲23例，≥60歲22例；高、中分化27例，低分化18例；全層浸潤(突破肌層至外膜)24例,未全層浸潤(未突破肌層)21例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期19例，Ⅲ、Ⅳ期26例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療，臨床資料完整。所有標(biāo)本分別在癌組織、癌旁不典型增生組織(取自距離癌組織邊緣5 cm以內(nèi))和正常食管黏膜組織(取自手術(shù)切緣或癌組織邊緣5 cm以外)3個部位取材，甲醛固定，石蠟包埋、5 μm厚連續(xù)切片,均經(jīng)HE染色病理診斷證實(shí)。

1.2USP22、C-myc、Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組化SP法。兔抗人USP22多克隆抗體(稀釋150倍使用)購自Abcam公司，兔抗人C-myc(稀釋150倍使用)和Caspase-3(稀釋100倍使用)多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。詳細(xì)步驟嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作。試劑公司提供的已知陽性的乳腺組織作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結(jié)果判定USP22及C-myc蛋白以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃(褐)色顆粒為陽性染色 ，Caspase-3以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。高倍鏡下選取10個視野，每個視野至少計數(shù)100個細(xì)胞，分別對陽性細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計分。陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，6%～為1分，26%～為2分，51%～為3分，>75%為4分；陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度：細(xì)胞無染色為0分，淡黃染色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項評分相乘，總分<1分為陰性(-)，≥1分為陽性(+)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0分析，3種組織中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較采用χ2檢驗；食管鱗癌組織中USP22與C-myc蛋白的表達(dá)，兩者與Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性采用Pearson等級相關(guān)分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 3種組織中USP22、C-myc、Caspase-3蛋白的表達(dá)見圖1和表1。可以看出，從正常組織、不典型增生組織到食管鱗癌組織，USP22、C-myc蛋白的表達(dá)依次增強(qiáng)，Caspase-3蛋白的表達(dá)逐漸降低。

圖1 3種組織中USP22(1)、C-myc(2)和Caspase-3(3)蛋白的表達(dá)(SP，×40)

表1 不同食管組織中USP22、C-myc及Caspase-3蛋白的表達(dá)陽性例數(shù)(%)

各組間兩兩比較,P均<0.05。

2.2USP22、C-myc和Caspase-3蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系見表2。USP22、C-myc蛋白的表達(dá)與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等有關(guān)，與患者年齡、性別等無關(guān)；Caspase-3蛋白的表達(dá)僅與腫瘤分化程度有關(guān)，與年齡、性別、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等均無關(guān)。

表2 USP22、C-myc和Caspase-3蛋白的表達(dá)與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系 陽性例數(shù)(%)

續(xù)表2

2.3食管鱗癌組織中USP22、C-myc及Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性USP22與C-myc表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)，兩者均與Caspase-3表達(dá)呈負(fù)關(guān)聯(lián)。見表3～5。

表3 食管鱗癌組織中USP22和C-myc蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

χ2=20.417，rP=0.559,P<0.001。

表4 食管鱗癌組織中USP22和Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

χ2=12.598，rP=-0.468,P<0.001。

表5 食管鱗癌組織中C-myc和Caspase-3蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性 例

χ2=10.900，rP=-0.477,P<0.001。

3 討論

食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，作為食管癌的高發(fā)及高死亡區(qū),我國每年因食管癌死亡的人數(shù)約為15萬,約占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4，早發(fā)現(xiàn)、早治療對食管癌的預(yù)后意義重大[3]。隨著科技的發(fā)展，腫瘤相關(guān)機(jī)制的研究日益清晰，分子靶向治療亦在食管癌治療中嶄露頭角。如何通過分子生物學(xué)手段，尋找易感基因，提高食管癌的早期診斷率及改善中晚期食管癌的治療療效已成為目前食管癌研究的主要方向。

原癌基因USP22 定位于17號染色體，是一種去泛素化肽酶，參與組蛋白去泛素化、乙酰化進(jìn)而參與 hSAGA復(fù)合物所調(diào)節(jié)的基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等[4]。其與BMI-1、Cyclin B1等11個基因一起被稱為癌死亡標(biāo)簽，在腫瘤的形成、侵襲生長、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等方面具有明確作用，且發(fā)揮廣泛的生理作用，如調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育、細(xì)胞周期、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[5-6]，其異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和治療、預(yù)后等密切相關(guān)。研究表明USP22可能參與C-myc、P53介導(dǎo)的下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)下調(diào)USP22，可抑制myc介導(dǎo)的靶基因JPO1、ODC、CAD、Cyclin D2和MTA1等的轉(zhuǎn)錄，而在沉默USP22后, P53調(diào)控的靶基因p21、PIG3 和PUMA的表達(dá)也下調(diào)。Atanassov等[8]研究發(fā)現(xiàn)，USP22通過對端粒 DNA 結(jié)合蛋白(TRF1)去泛素化作用調(diào)節(jié)端粒動態(tài)平衡。該研究結(jié)果顯示：USP22蛋白在食管正常組織、癌旁不典型增生組織、癌組織中的陽性表達(dá)率逐漸升高，其表達(dá)與腫瘤的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等有關(guān)。這與Li等[9]研究一致，提示USP22的過表達(dá)使腫瘤易于發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，是評價腫瘤分級，判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。

C-myc屬于myc癌基因家族，是多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游靶點(diǎn)，其激活是腫瘤發(fā)生的起始事件之一。C-myc通過與Ras、Sis、Fos等偶聯(lián)激活、抑制Cyclin E活性、激活hTERT表達(dá)等多種途徑導(dǎo)致腫瘤形成；通過抑制P21、P27等抑癌基因可使腫瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，更易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。該研究發(fā)現(xiàn)，食管正常組織、癌旁不典型增生組織和食管鱗癌組織中C-myc的陽性表達(dá)率逐漸升高，其表達(dá)與腫瘤的浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等相關(guān)。這一結(jié)論與Wang等[10]的研究一致，與Gomes等[11]的結(jié)果不一致，原因有待進(jìn)一步研究。

Caspase-3是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點(diǎn)，其激活后產(chǎn)生激活型Caspase-3，能使眾多與細(xì)胞周期、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及DNA修復(fù)等相關(guān)的蛋白或激酶失活，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]，在死亡受體通路及線粒體通路等誘導(dǎo)的凋亡過程中扮演重要角色。腫瘤的形成與凋亡障礙密切相關(guān)，Caspase-3在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情況的研究成為腫瘤分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。Caspase-3活性可作為評價腫瘤治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，探究增加或抑制Caspase-3活性的因素在腫瘤病因?qū)W及防治學(xué)研究方面具有重要作用。Jiang等[13]研究表明Caspase-3在中國食管癌高發(fā)區(qū)食管癌中表達(dá)升高，且與細(xì)胞分化程度、浸潤深度及臨床分期等相關(guān)。王克文等[14]研究表明食管癌組織中Caspase-3表達(dá)明顯低于正常食管組織，表達(dá)程度與腫瘤的分化程度相關(guān)，與腫瘤的浸潤深度等臨床特征均無相關(guān)性，與該研究結(jié)論一致。亦有研究[15]表明食管癌中Caspase-3表達(dá)低于正常組織，且表達(dá)率與癌組織浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。這些結(jié)論差異很大，表明Caspase-3具體機(jī)制尚未完全清楚,需進(jìn)一步研究。

周英妹等[16]研究發(fā)現(xiàn)USP22與C-myc存在密切關(guān)系,耗竭細(xì)胞的USP22可阻止C-myc工作,使其所致癌細(xì)胞的侵入性生長停止,C-myc激活的基因轉(zhuǎn)錄過程需要USP22,USP22是一個完整轉(zhuǎn)錄過程的控制者。該研究還發(fā)現(xiàn)，USP22與C-myc表達(dá)呈正相關(guān)，與Caspase-3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，前兩者高表達(dá)標(biāo)志著腫瘤預(yù)后不良，Caspase-3的活性則可以成為腫瘤治療反應(yīng)的預(yù)測信號。

綜上所述，該實(shí)驗通過研究三者在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)及其關(guān)系，希望為食管癌診斷、治療、預(yù)后判定等提供新的切入點(diǎn)。

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(2013-10-13收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expressions of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in esophageal squamous carcinoma

GUOYanli1),LIYingxia1),CHENKuisheng2),LIShenglei2),WENHongtao1)

1)DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

2)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

ubiquitin-specific processingpeptidase 22;C-myc;Caspase-3;esophageal squamous cell carcinoma

Aim: To investigate the expression and clinical significance of USP22, C-myc and Caspase-3 proteins in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC). Methods: SP method of immunohistochemical was used to examine the expressions of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in 45 cases of ESCC,the atypical hyperplasia and normal esophageal tissues. Results: The positive expression rates of USP22,C-myc and Caspase-3 proteins in 45 cases of ESCC were 60.00%,66.67%,31.11%, respectively. There were significant differences between ESCC,the atypical hyperplasia tissues and normal esophageal mucosa(χ2=39.614,41.838 and 33.889，P<0.001)；There was relationship in the expression intensity of USP22 ,C-myc proteins and the differentiation grade of carcinoma, invasion,lymph node metastasis and clinical stages(P<0.05),The expressive intensity of Caspase-3 protein was related with the differentiation grade of carcinoma merely(P<0.05)；The expression level of USP22 was positively correlated with that of C-myc(rP=0.559,P<0.001)，both of them was negatively correlated with that of Caspase-3(rP=-0.468 and -0.477,P<0.001). Conclusion: The high level of USP22 and low level of C-myc might be necessary in the development and evolution of ESCC.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.003

R735.1